董西林 周 晶 陳真真 王雅娟 李家芝

肺癌是目前發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。大多數(shù)肺癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)多為臨床中晚期，失去了手術(shù)時(shí)機(jī)，化療成為晚期肺癌治療的主要手段,但其有效率較低,其中癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥尤其是多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)成為取得療效的重要障礙[1,2]。近年來有關(guān)肺癌耐藥相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)之一，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因及蛋白的異常表達(dá)與肺癌化療耐藥和療效及預(yù)后有著密切的關(guān)系。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)，檢測(cè)手術(shù)切除或支氣管鏡活檢取得的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中的肺耐藥蛋白LRP(Lung resistance-associated protein，LRP)及β-微管蛋白(βⅢ-tubulin)表達(dá)情況，并探討其相關(guān)性，為NSCLC患者化療方案的選擇和改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2006年6月～2009年12月手術(shù)切除的肺組織及支氣管鏡下取活檢肺組織，共80例，其中包括收集肺癌組織60例，良性肺疾病(benign lung diseases,BLDs)10例，正常肺組織10例。所有患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)，肺癌患者術(shù)前均未行放療和化療。NSCLC患者60例，男性42例，女性18例，男女比例為7∶3；鱗癌34例，腺癌26例。年齡31～75歲，中位年齡53歲。肺癌的TNM分期嚴(yán)格按照術(shù)后病例國際分期系統(tǒng)TNM分期( UICC，2002年 )：Ⅰ期19例，Ⅱ期19例，Ⅲ期+Ⅳ期22例。BLDs 10例，包括肺結(jié)核6例，炎性假瘤2例，肺膿腫2例。10例正常肺組織由我院胸外科提供，其中肺大泡7例，肺隔離癥3例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采集每位受檢者肺組織，常規(guī)中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片4 μm。應(yīng)用鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(即免疫組化S-P法)，檢測(cè)收集的石蠟標(biāo)本相關(guān)耐藥蛋白指標(biāo)表達(dá)情況。兔抗人LRP及βⅢ-tubulin多克隆抗體(購自Santa Cruz公司，美國)，生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白及SP試劑盒均為美國Zymed公司產(chǎn)品。操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)10%多聚甲醛固定，石臘包埋后連續(xù)切片(4 μm)，常規(guī)脫臘至水，3%過氧化氫封閉，微波爐抗原修復(fù)后加入1∶100稀釋的LRP(或βⅢ-tubulin)多克隆抗體4℃過夜，二抗置室溫下15 min，加入辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液靜置15 min，PBS漂洗后DAB顯色，逐級(jí)乙醇脫水，透明樹脂封片。以PBS代替一抗設(shè)定為陰性空白對(duì)照，同時(shí)用已知肺癌陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

陽性判斷采用半定量分析方法,每1例陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)500個(gè),計(jì)算百分比。LRP陽性者胞質(zhì)呈棕黃色,陽性細(xì)胞率<1%為“-”；1%～ 40%為“+”；41%～75%為“++”；>75%為“+++”。βⅢ-tubulin陽性者胞質(zhì)呈棕黃色。陽性細(xì)胞率<5%為“-”；5%～50%為“+”；50%～75%為“++”；>75%為“+++” 。設(shè)定“+”為低表達(dá),“++”和“+++”為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和處理。樣本陽性表達(dá)計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 LRP及βⅢ-tubulin在NSCLC組織和正常對(duì)照組中的表達(dá)

在60例NSCLC患者中LRP陽性表達(dá)率為73.33%，βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率為76.67%，兩者均顯著高于對(duì)照組(P<0.01),見表1。

表1 NSCLC與對(duì)照組中LRP、βⅢ-tubulin蛋白表達(dá)的比較(例，%)

*為與對(duì)照組比較P<0.01

2.2 LRP表達(dá)與患者性別、是否吸煙、病理類型、臨床分期及分化程度的關(guān)系

在60例NSCLC患者中LRP陽性表達(dá)率為73.33%；LRP蛋白表達(dá)與患者性別無明顯相關(guān)性(P>0.05)。在43例吸煙NSCLC患者中LRP陽性表達(dá)率為74.41%，LRP蛋白表達(dá)與肺癌患者是否吸煙無明顯關(guān)系(P>0.05)。在34例鱗癌患者中LRP陽性表達(dá)率為54.55%，在26例腺癌患者中為76.92%，兩者比較差異無顯著性(P>0.05)。說明LRP表達(dá)與肺癌組織類型無顯著相關(guān)性(P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ期中LRP陽性表達(dá)率分別為89.47%、73.68%和59.09%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，三者間差異無顯著性(P>0.05)。說明LRP蛋白表達(dá)與肺癌臨床分期無明顯關(guān)系(P>0.05)。高、中、低分化NSCLC中LRP陽性表達(dá)率分別為53.85%、66.67%和91.30%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，三者間有顯著性差異(P<0.05)。提示LRP蛋白表達(dá)與肺癌分化程度明顯相關(guān)，分化程度越低陽性表達(dá)率越高，見表2。

2.3 βⅢ-tubulin表達(dá)與患者性別、是否吸煙、病理類型、臨床分期及分化程度的關(guān)系

60例NSCLC患者中βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率為76.67%，βⅢ-tubulin表達(dá)與患者性別無明顯關(guān)系(P>0.05)。43例吸煙NSCLC患者中βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率為76.74%，βⅢ-tubulin表達(dá)與肺癌患者是否吸煙無明顯相關(guān)性(P>0.05)。34例鱗癌患者中βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率為76.47%，26例腺癌患者中為76.92%，兩者比較差異無顯著性(P>0.05)，提示βⅢ-tubulin表達(dá)與肺癌組織類型無明顯相關(guān)性。不同臨床各分期中βⅢ-tubulin表達(dá)率分別為Ⅰ期84.21%，Ⅱ期94.74%，Ⅲ+Ⅳ期54.55%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異無顯著性(P>0.05)，說明βⅢ-tubulin表達(dá)與腫瘤臨床分期無明顯相關(guān)性。高、中、低度分化NSCLC患者βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率分別為84.62%、79.17%和69.57%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，三者之間差異無顯著性(P>0.05)。說明βⅢ-tubulin陽性表達(dá)與肺癌分化程度無明顯相關(guān)性，見表2。

表2 LRP和βⅢ-tubulin表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系( 例，%)

2.4 LRP與βⅢ-tubulin表達(dá)的相關(guān)性

將LRP及βⅢ-tubulin陽性表達(dá)情況按照程度進(jìn)行分級(jí)，其中“0”、“1”、“2”、“3”分別代表“-”、“+”、“++”、“+++”。上述所得試驗(yàn)結(jié)果采用spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示LRP與βⅢ-tubulin表達(dá)間呈明顯正相關(guān)(γ=0.293，P<0.05)，即隨著LRP表達(dá)水平增高，βⅢ-tubulin表達(dá)水平亦呈明顯升高趨勢(shì)，見表3。

表3 LRP及βⅢ-tubulin表達(dá)相關(guān)性分析(例)

3 討論

3.1 肺耐藥蛋白與肺癌耐藥

肺耐藥蛋白(LRP)是非ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要參與細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。LRP在MDR中的作用和機(jī)制,目前觀點(diǎn)傾向于認(rèn)為LRP可能通過兩種機(jī)制引起MDR:①它可以使以通過靶點(diǎn)屏蔽機(jī)制使以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物不能通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核,即使進(jìn)入也在其發(fā)生藥效前被泵出細(xì)胞核;②可使細(xì)胞質(zhì)中的藥物進(jìn)入囊泡,并通過胞吐作用排出細(xì)胞外[3]。LRP在人正常組織和腫瘤細(xì)胞中均廣泛分布,被認(rèn)為具有組織特異性。LRP主要介導(dǎo)烷化劑與鉑類的耐藥，這些藥均以DNA為靶，故提示LRP主要通過核靶點(diǎn)的屏蔽機(jī)制介導(dǎo)MDR。近年來LRP被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞中有高表達(dá)[4,5]。朱春榮等[6]研究發(fā)現(xiàn)LRP在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于SCLC組織,且在腺癌中的表達(dá)水平明顯高于鱗癌，LRP和MDR1基因蛋白產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì)肺癌患者的診治和預(yù)后評(píng)估有積極意義。曾寧等[7]對(duì)46例NSCLC組織和16例正常肺組織LRP表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LRP在NSCLC組織中的表達(dá)率明顯高于正常肺組織中的表達(dá)；LRP表達(dá)與患者組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，低分化高表達(dá)，高分化低表達(dá)；LRP表達(dá)陽性的NSCLC患者生存期短，預(yù)后差。目前關(guān)于逆轉(zhuǎn)與LRP有關(guān)的MDR研究主要是抑制LRP基因的表達(dá)或者影響耐藥細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度等，但是還沒有明確的效果[8,9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LRP在正常肺組織、肺結(jié)核組織中可表現(xiàn)為低表達(dá)或不表達(dá)，而在NSCLC癌組織中則為強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率73.33%；LRP表達(dá)與患者性別、是否吸煙、病理類型及臨床分期各方面均未見明顯差異，但在腺癌(76.92%)中的表達(dá)率高于鱗癌(54.55%)，但是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，兩者之間不具有顯著性差異，說明由LRP介導(dǎo)的MDR在鱗癌和腺癌中的發(fā)生率相當(dāng)；LRP蛋白表達(dá)與肺癌分化程度有明顯關(guān)系，高、中、低分化NSCLC中陽性表達(dá)率分別為53.85%、66.67%和91.30%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三者之間有顯著性差異，分化程度越低，陽性表達(dá)率越高，提示肺癌惡性程度越高，耐藥性越強(qiáng)，對(duì)化療藥物敏感性越差，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。可見，在非小細(xì)胞肺癌中LRP是預(yù)測(cè)化療敏感性的重要指標(biāo)，陽性表達(dá)率越高者對(duì)化療藥物敏感性越差，耐藥性越強(qiáng)，導(dǎo)致化療效果不佳。因此LRP可作為1種較好的預(yù)測(cè)化療藥物敏感性的指標(biāo)。

3.2 β-微管蛋白與肺癌耐藥

β-微管蛋白(β-Tubulin)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，紫杉醇結(jié)合于β-微管蛋白N端第31個(gè)氨基酸上，該位點(diǎn)在種屬間保持高度保守。到目前為止，對(duì)許多腫瘤進(jìn)行了不同β-微管蛋白同型與紫杉醇耐藥相關(guān)性的研究，其中乳腺癌及卵巢癌研究較多，肺癌相對(duì)較少。目前β-微管蛋白引起紫杉醇耐藥的具體機(jī)制還不明確，Kamath等[10]推測(cè)Ⅲ型β微管蛋白過表達(dá)引起紫杉醇耐藥的途徑可能有2種：①通過β微管蛋白Ⅲ型過表達(dá)而降低紫杉醇抑制微管蛋白解聚的效應(yīng),從而誘導(dǎo)紫杉醇耐藥，即組成性的加強(qiáng)耐藥細(xì)胞微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，從而對(duì)抗了紫杉醇的微管穩(wěn)定作用；②降低微管對(duì)紫杉醇抑制動(dòng)力效應(yīng)的敏感性。Verdier 等[11]發(fā)現(xiàn)在6種同型中只有β微管蛋白Ⅲ型表達(dá)增高，推測(cè)它才是微管作用藥物耐藥的唯一標(biāo)志物。Seve等[12]選擇91例Ⅲ或Ⅳ期的NSCLC患者，用免疫組化法測(cè)定Ⅲ型β微管蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)47例紫杉醇化療的患者中，反應(yīng)率為37.5%，其中低表達(dá)Ⅲ型β微管蛋白的患者獲得了較好的反應(yīng)率，且獲得了較長的無病生存期和總生存期，而在其余44例患者中未發(fā)現(xiàn)區(qū)別。楊俊全等[13]研究分析75例接受以紫杉類化療的Ⅳ期NSCLC臨床病理資料，βⅢ-tubulin陽性表達(dá)率(≥50%陽性染色細(xì)胞)為58.7%，與患者性別、年齡及組織類型無關(guān)。βⅢ-tubulin高表達(dá)患者紫杉類化療有效率低(25.0%)，進(jìn)展率高(25.0%)，而βⅢ-tubulin低表達(dá)患者化療有效率高(48.9%)，進(jìn)展率低(6.4%)。證實(shí)βⅢ-tubulin高表達(dá)NSCLC患者對(duì)紫杉類藥物耐藥且預(yù)后不良。Yoshiki等[14]分析58例NSCLC術(shù)后組織，發(fā)現(xiàn)表達(dá)明顯升高的βⅢ-tubulin與紫杉醇類化療藥物有顯著相關(guān)，但是與吉西他濱耐藥無明顯相關(guān)性。并且這種耐藥性與患者的年齡、性別、組織學(xué)類型、臨床分期等無明顯相關(guān)性。

在本研究中觀察到βⅢ-tubulin在NSCLC組織及癌旁正常組織中均有表達(dá)，但正常組織中的表達(dá)強(qiáng)度較低，僅為1個(gè)(+)或(-)，而在癌組織中表達(dá)尤為顯著，多為(++)和(+++)，陽性表達(dá)率達(dá)76.67%。βⅢ-tubulin表達(dá)情況與患者性別、是否吸煙、肺癌組織類型、臨床分期及分化程度等均無明顯相關(guān)性,推測(cè)βⅢ-tubulin在介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌MDR中具有廣泛存在的現(xiàn)象。

3.3 肺癌耐藥蛋白與β-微管蛋白的相關(guān)性

本研究中將LRP和βⅢ-tubulin陽性表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)LRP與βⅢ-tubulin表達(dá)間呈明顯正相關(guān)，即隨著LRP表達(dá)水平增高，βⅢ-tubulin表達(dá)水平呈明顯上升趨勢(shì)。這點(diǎn)也可以解釋臨床上LRP表達(dá)增高介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，并且LRP在易產(chǎn)生化療多藥耐藥性的NSCLC中表達(dá)明顯高于SCLC,而在化療敏感的鱗癌中表達(dá)又明顯低于腺癌；細(xì)胞內(nèi)βⅢ-tubulin水平可影響化療藥物的抗腫瘤活性,其表達(dá)越高,對(duì)抗癌藥物敏感性越低，耐藥性越高，其含量和活性的升高可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥產(chǎn)生; βⅢ-tubulin介導(dǎo)的耐藥在NSCLC比SCLC常見,且常與LRP 等介導(dǎo)的耐藥共存。

肺癌對(duì)化療多藥耐藥是1個(gè)多基因，多因素的復(fù)雜過程，它們之間互相依賴、互相調(diào)節(jié)。解決肺癌多藥耐藥的關(guān)鍵是在于闡明MDR的機(jī)制。隨著MDR研究的深入，相信人類最終能克服肺癌的MDR現(xiàn)象，在肺癌的化療方面實(shí)現(xiàn)突破性進(jìn)展。聯(lián)合檢測(cè)肺癌組織中耐藥相關(guān)基因及其蛋白的表達(dá)有利于選擇具有針對(duì)性的化療藥物，正確制定化療方案，判斷化療療效及預(yù)后。有關(guān)LRP、βⅢ-tubulin與肺癌多藥耐藥的研究尚需進(jìn)一步深入。

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