陸洪炳 殷飛燕

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率只有約20%。胃癌的侵襲和轉移是影響胃癌預后的主要因素之一。Snail是具有鋅指結構的轉錄因子，近年來其在腫瘤的轉移中越來越受到人們的關注。研究表明，Snail高表達于乳腺癌[1]、結腸癌[2]、肝癌[3]等中,并與乳腺癌組織學分級、淋巴結轉移及遠處轉移密切相關[1]。鄭振波等[4]通過原位分子雜交技術分析發(fā)現(xiàn)，Snail mRNA在不同分化程度胃癌細胞中呈差異性表達。Kurrey等[5]研究表明,卵巢癌細胞轉入外源Snail后,細胞的侵襲性和運動能力都增強。TGF-β1可通過多種途徑調節(jié)Snail的表達[6～8]，本實驗采用RT-PCR方法，檢測在TGF-β1調節(jié)下，不同分化程度的胃癌細胞中SnailmRNA表達是否有差異，為判斷胃癌患者預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901(中分化)、BGC-823(低分化)、HGC-27(未分化)購置中國科學院上海細胞生命科學研究院，人重組TGF-β1為Peprotech公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，10%新生牛血清為杭州四季清生物工程材料有限產(chǎn)品，1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，DNAMarker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901、BGC-823細胞用含有10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)、HGC-27細胞用含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2的孵箱內。取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2 RT-PCR Snail及內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司代為設計。Snail上游引物為5’-TTACCTTCCAGCAGCCCT AC-3，下游引物為5’-GCT TCGGATGTGCATCTTG-3’，擴增片段440 bp。GAPDH上游引物為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴增片段258 bp。

提取正常培養(yǎng)基及5、10 ng/ml TGF-β1培養(yǎng)24 h的細胞RNA。用離線柱型提取細胞RNA,RT-PCR按天根一步法步驟進行操作：①反轉錄反應,50℃ 30 min ；②PCR初始變性，94℃ 2 min ；③變性94℃ 0.5 min ；④退火，55℃ 0.5 min；⑤延伸，65℃ 45 s從3～5步進行33個循環(huán)；⑥最終延伸，65℃ 10 min。

取8 μl PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透視燈下觀察出現(xiàn)440 bp條帶即為Snailc DNA陽性，最后對凝膠進行灰度掃描并照相，以掃描所得Snail與GAPDH灰度值的比值作為Snail mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

在正常培養(yǎng)基培養(yǎng)下，三株細胞系Snail mRNA表達有顯著性差異(P<0.05)，隨著腫瘤分化程度的降低，Snail mRNA表達含量增加；5 ng/ml TGF-β1調節(jié)下，三株細胞系Snailm RNA表達有差異(P<0.05)，隨著腫瘤分化程度的降低，Snailm RNA表達含量增加；10 ng/ml TGF-β1調節(jié)下，三株細胞系Snail mRNA表達有顯著性差異(P<0.05)，隨著腫瘤分化程度的降低，Snail mRNA表達量增加，見圖1～2。

圖1 不同濃度TGF-β1對三株細胞系表達的影響

A 為SGC-7901細胞株 ；B 為BGC-823細胞株；C為HGC-27細胞株；1為0 ng/ml TGF-β1作用；2為5 ng/ml TGF-β1作用；3為10 ng/ml TGF-β1作用

圖2 不同濃度TGF-β1對不同分化程度人胃癌細胞Snail mRNA表達的作用

3 討論

惡性腫瘤是危害人類健康最為嚴重的一類疾病，在我國胃癌約占1/3，其死亡率較高。影響胃癌生存的因素比較復雜，與胃癌的分化程度、浸潤深度、是否有轉移等因素有密切的關系，而胃癌的浸潤轉移是1個復雜的多環(huán)節(jié)過程，也是胃癌致死性的關鍵因素。腫瘤浸潤轉移過程其分子機制涉及眾多相關基因的改變，其中Snail也是研究較多的與腫瘤密切相關的基因之一。轉錄因子Snail 1984年Nusslein-Volhard等[9]首先是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的。隨后發(fā)現(xiàn)，Snail的同源分子在許多種屬的動物中均存在。其家族成員有:Snail、E12/E47、ZEBl、SIPl、Slug。在結構特征上,Snail家族具有相似的結構,由1個高度保守的羧基末端以及1個高度可變的氨基末端構成,各成員間結構上的不同主要表現(xiàn)在中間P-S富集區(qū)域。張莉麗等[10]研究發(fā)現(xiàn),正常胃黏膜組織中Snail mRNA表達水平較低,隨著胃癌的發(fā)生、侵襲及浸潤性的增強而表達增強,特別是在TNMⅢ～Ⅳ期、分化程度減低及伴有淋巴結轉移和血脈管侵犯的胃癌中Snail mRNA過表達。

E-cadherinherin，1種鈣離子依賴的黏附分子，被認為是Snail直接作用的靶基因。在對E-cadherinherin啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，在啟動子5，端序列存在調節(jié)元件，這個調節(jié)元件包含有2個E-box(E-盒)結構，其內含一致的5，-CAGGTG序列，Snail可與E-box結合，在轉錄水平上抑制E-cadherinherin的表達[11]。這一過程能使基因發(fā)生變異的細胞更加容易發(fā)生浸潤和轉移。卓文磊等[12]發(fā)現(xiàn),正常人肺腺癌A549細胞能表達較高水平的Snail和α-SMA,而E-cadherin呈低表達。用RNA干擾技術阻滯其Snail表達后,A549細胞α-SMA表達降低,E-cadherin表達則升高，他們發(fā)現(xiàn)在阻滯其Snail表達后,穿過屏障的A549細胞明顯減少,證明A549細胞侵襲能力受到抑制。

本實驗結果顯示：SnailmRNA在不同胃癌細胞系中差異表達，Snail在分化程度越低的胃癌細胞中表達越高，與[4][10]的結果相吻合。提示snail在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用,其mRNA過表達可促進胃癌的發(fā)生、浸潤和轉移。因此通過RNAi干擾或反義RNA技術抑制Snail的表達，或者競爭性抑制Snail和E-cadherin的結合，均可切斷這一途徑對胃癌進展的促進作用。

綜上所述，Snail的表達水平與胃癌的分化程度有關，而腫瘤分化程度越差，惡性程度越高，預后越差。將來Sanil可能會成為新的抗腫瘤治療的靶點，也可作為判斷腫瘤患者預后的指標。

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