徐躍飛 任 鳳 趙寶昌

蛇毒去整合素(disintegrins)是一類從出血性蛇毒中分離出的含RGD(Arg-Gly-Asp，RGD)或KGD(Lys-Gly-Asp，KGD)模體的小分子蛋白質(zhì)。此蛇毒蛋白家族可憑借其RGD分子序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)拮抗劑，具有抑制血小板聚集和血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移等功能[1～3]。Adinbitor是本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)旅順白眉蝮蛇的毒腺中通過基因克隆的方法獲得的1種含有RGD模體的去整合素，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它具有抑制血小板聚集和血管新生功能，并具有顯著抑制腫瘤生成的作用[4]。本研究旨在研究Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，為其研制開發(fā)成新的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

Adinbitor克隆于大連產(chǎn)白眉腹蛇毒腺[5]，由本實(shí)驗(yàn)室保存。B16黑色素瘤細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自GIBCO BRL公司；新生小牛血清購自聯(lián)星科技生物公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Amresco產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)購自北京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室；Transwell購自Corning Costar 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

B16黑色素瘤細(xì)胞于含已滅活的10%新生小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、105U/L青霉素和0.1 g /L鏈霉素“雙抗溶液”的DMEM培養(yǎng)基(pH 7.2)中，以37℃、5% CO2和90%濕度的條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT比色法。B16黑色素瘤細(xì)胞(2×104cell/well)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于DMEM中培養(yǎng)24 h。按設(shè)定濃度加入Adinbitor(對(duì)照加入同量的PBS)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入培養(yǎng)液量10%的濃度為0.5 mg/ml的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液等量的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定A490。按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=(對(duì)照孔A490均值-試驗(yàn)孔A490均值)/對(duì)照孔A490均值×100%

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將黑色素瘤細(xì)胞(3×105cell/well)接種于放置于六孔板中的滅菌蓋玻片上培養(yǎng)過夜,加入0、0.6、1.2和2.4 μmol/L的Adinbitor進(jìn)行細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo),加入0.5 ml固定液，固定10 min,用PBS洗2遍，每次3 min,加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，使細(xì)胞接觸封片液，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。

1.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

纖連蛋白FN稀釋于PBS中至終濃度0.1 mg/ml。以每孔40 μl包被96孔板，4℃過夜。次日用1%BSA封閉2 h。B16黑色素細(xì)胞按1×104cell/well的量接種于96孔板中,設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組將Adinbitor濃度為0、2.0、3.5和5.0 μmol/L加入，37℃孵育2 h。PBS洗去未黏附細(xì)胞，黏附細(xì)胞用4%多聚甲醛-PBS固定10 min，0.4%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗去多余染料并干燥后，加入1%SDS溶解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀測(cè)A570，以A570均值代表黏附細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液加入Transwell的下室內(nèi)預(yù)熱1 h，用解剖鑷子將細(xì)胞培養(yǎng)嵌套固定在培養(yǎng)板的孔壁上，將B16黑色素瘤細(xì)胞懸液(1×104cell/well)接種于上室內(nèi)，加入不同濃度的Adinbitor處理細(xì)胞，終濃度分別為0、1.1、3.3和5.5 μmol/L，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中16 h。將Transwell上表面的非遷移細(xì)胞擦掉，4%多聚甲醛-PBS固定10 min，取下帶有細(xì)胞的聚碳酸酯膜，反面朝上，以O(shè)lympus相差顯微鏡觀察并拍照，每個(gè)樣片隨機(jī)取4個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。每組重復(fù)5次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

未經(jīng)Adinbitor處理的細(xì)胞的Hoechst染色淡而均勻，細(xì)胞呈均勻分布；而經(jīng)Adinbitor處理的細(xì)胞核因染色質(zhì)固縮從而結(jié)合Hoechst的能力增強(qiáng)，亮度高并且細(xì)胞明顯皺縮成團(tuán)。本實(shí)驗(yàn)以終濃度分別為0.6、1.2、2.4 μmol/L的Adinbitor作用于B16黑色素瘤細(xì)胞18 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，結(jié)果隨Adinbitor濃度增加細(xì)胞凋亡越發(fā)明顯(圖1)。

圖1 Adinbitor誘導(dǎo)B16黑色素細(xì)胞調(diào)亡引起的細(xì)胞核形態(tài)變化(Olympus熒光顯微鏡,200×)

2.2 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞有劑量效應(yīng)關(guān)系。Adinbitor抑制B16黑色素瘤細(xì)胞增殖的半效應(yīng)量(mddian infective dose，ID50)為2.68 μmol/L(圖2)。

2.3 Adinbitor對(duì)FN誘導(dǎo)的B16黑色素瘤細(xì)胞黏附的影響

2.0、3.5和5.0 μmol/L濃度的Adinbitor作用2 h后，可明顯抑制B16黑色素瘤細(xì)胞黏附FN基質(zhì)，隨著濃度的增加黏附細(xì)胞數(shù)下降，分別為0.91±0.03、0.82±0.02和0.73±0.01個(gè)，各濃度組與對(duì)照組(0 μmol/L)的(1.13±0.06)個(gè)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01(圖3)。

圖2 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

圖3 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞黏附FN的影響

2.4 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響

以對(duì)照組(0 μmol/L)，1.1、3.3和5.5 μmol/L濃度的Adinbitor處理B16黑色素瘤細(xì)胞16 h后，各組遷移細(xì)胞數(shù)分別為98.2±8.93、80.1±6.72、58.7±4.12和36.8±3.83個(gè)。各濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均<0.01。Adinbitor可以抑制B16黑色素瘤細(xì)胞遷移能力，且呈明顯量效關(guān)系(圖4)。

圖4 Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

腫瘤是1種細(xì)胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，腫瘤細(xì)胞就有可能停止生長(zhǎng)，因而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為篩選抗腫瘤藥物1個(gè)新的重要指標(biāo)，開發(fā)毒性作用小并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥物也是腫瘤藥物研發(fā)工作者研究的新領(lǐng)域。目前已有多種來自于蛇毒的去整合素被證實(shí)除了可以通過抑制腫瘤血管生成達(dá)到抗腫瘤的目的外，還可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法發(fā)現(xiàn)Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤的抗增殖作用具有藥物劑量依賴關(guān)系，其抑制增殖的ID50為2.68 μmol/L。在其誘導(dǎo)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，通過Hoechst染色證實(shí)了Adinbitor具有誘導(dǎo)B16黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外類似研究表現(xiàn)了相同趨勢(shì)[6,7]。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是1個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程。腫瘤細(xì)胞的黏附在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起重要作用，是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的前題和始動(dòng)因素。高侵襲的腫瘤細(xì)胞與基膜成分的異質(zhì)性黏附能力通常增高，而腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力會(huì)下降。這種特性有利于腫瘤細(xì)胞侵犯基膜等組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Adinbitor能降低B16黑色素瘤細(xì)胞在FN基膜上的黏附，不同濃度的Adinbitor作用2 h后，黏附細(xì)胞數(shù)下降，表明Adinbitor具有抗黏附作用。

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官或組織，首先要降解并穿過基膜浸潤(rùn)到周緣組織，并進(jìn)一步降解血管內(nèi)皮下基膜進(jìn)入循環(huán)，因此遷移是侵襲力必要條件。體外小室細(xì)胞培養(yǎng)模型是綜合判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力、分析腫瘤細(xì)胞黏附、降解和穿透轉(zhuǎn)移能力及相互間聯(lián)系的最有效且較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。小室內(nèi)不鋪基膜，觀察穿膜細(xì)胞數(shù)能檢測(cè)腫瘤體外遷移能力。我們用小室法觀察到Adinbitor有較強(qiáng)的抑制B16黑色素瘤細(xì)胞遷移的能力，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)，且有劑量效應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，Adinbitor對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞不僅有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，而且有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞黏附和遷移作用，是具有前途的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入探討。

[1] Yang RS,Tang CH,Chuang WJ,et al.Inhibition of tumor formation by snake venom disintegrin〔J〕.Toxicon,2005,45(5):661.

[2] Sohn Y D,Hong S Y,Cho K S,et al.Acute and repeated dose toxicity studies of recombinant saxatilin，a disintegrin from the Korean snake(gloydius saxatilis)〔J〕.Toxicon,2008,51(3):406.

[3] Minea R,Swenson S,Costa F,et al.Development of a novel recombinant disintegrin,contortrostin,as an effective anti-tumor and anti-angiogenic agent〔J〕.Pathophysiol Haemost Thromb,2005,34(4-5):1773.

[4] Wong JH,Wu Y,Ren F,et al.Cloning and characterization of Adinbitor，a novel disintegrin from the samke venom of Agkistroden halys brevicaudus stejneger〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2004,36(6):425.

[5] 王繼紅，任 鳳，吳 毓，等.白眉蝮蛇去整合素Adinbitor 的基因克隆、表達(dá)及其部分生物學(xué)活性〔J〕.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004,20(6):745.

[6] Chung KH，Kim SH，Han KY，et al.Inhibitory effect of salmosin，a Korean snake venom-derived disintegrin，on the integrin alphav-mediated proliferation of SK-Mel-2 human melanoma cells〔J〕.J Pharm Pharmacol，2003，55(11):1577.

[7] Kang IC，Kim DS，Jang Y，et al.Suppressive mechanism of salmosin，a novel disintegrin in B16 melanoma cell metastasis 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000，275(1):169.