王紅兵 王亞麗 劉德生 徐海洋 裴冬生 祖茂衡

尿多酸肽(CDA-Ⅱ )是從健康人尿中提取經(jīng)純化制得的，含有多種有機(jī)酸和多肽成分，本研究采用MTT法檢測(cè)尿多酸肽對(duì)A549細(xì)胞的作用，甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)人肺腺癌A549細(xì)胞株E-cadherin基因甲基化的狀況，以探討尿多酸肽的抗腫瘤作用及作用機(jī)制，為肺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

尿多酸肽是由合肥永生制藥公司生產(chǎn)，MTT試劑盒購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司，E-cadherin基因甲基化檢測(cè)試劑盒為GENMED公司產(chǎn)品，人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng) 取A549細(xì)胞用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 天更換 1 次培養(yǎng)液。

1.2.2 MTT法測(cè)定A549細(xì)胞存活率 取指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的CDA-Ⅱ，對(duì)照組加入等體積的DMEM，37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加20 μl MTT溶液于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱溫育4 h。吸去上清，每孔加150 μl二甲基亞砜，震蕩約10 min混勻。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度(A490) 值。細(xì)胞存活率(%)= (CDA-Ⅱ平均A 值/對(duì)照平均A 值)×100%。

1.2.3 甲基化特異性PCR(MSP) 收集不同處理組細(xì)胞，參照細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，在UV 3 000紫外分光光度儀上測(cè)定吸光度值鑒定DNA純度，A260/A280比值均在1.8～2.0之間。取2 μg基因組DNA參照E-cadherin基因甲基化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行甲基化修飾。分別取修飾DNA及未修飾DNA 100 ng進(jìn)行MSP反應(yīng)。E-cadherin基因甲基化引物：M，F(xiàn)：5’-TTAGGTTAGAGGG T TATCGCGT-3’，R:5’-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3’。非甲基化引物：U，F(xiàn):5’-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3’，R:5’-CA CAACCAATCAACAACACA-3’。反應(yīng)體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進(jìn)行:PCR混合液15 μl，上下游引物各1 μl,模板1 μl。PCR反應(yīng)時(shí)間和溫度：95℃預(yù)變性9 min，95℃變性30 s，甲基化引物在57℃退火30 s，非甲基化引物在53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)擴(kuò)增35次，72℃ 5 min。使用Gene Amp PCR System 2400擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)。取10 μl PCR產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN MD 101為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker同步電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析。M陽(yáng)性，U陰性為完全甲基化，M陽(yáng)性，U陽(yáng)性為部分甲基化，M陰性，U陽(yáng)性為非甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。SPSS對(duì)MTT數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位模型分析，回歸方程經(jīng)過(guò)幾次疊代運(yùn)算后確定，如方程擬合優(yōu)度檢驗(yàn)χ2值、P值(>0.05),說(shuō)明曲線擬合良好，并顯示各效應(yīng)概率水平的劑量值(包括0.50,即IC 50 )。

2 結(jié)果

2.1 尿多酸肽對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

尿多酸肽顯著抑制人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著劑量的增加其抑制作用增強(qiáng)，2.00 mg/ml 尿多酸肽作用24 h后A549細(xì)胞存活率僅為3.9%，半數(shù)抑制濃度IC 50為0.23 mg/ml，見(jiàn)表1。

表1 尿多酸肽對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

注：數(shù)值經(jīng)SPSS軟件分析，χ2=0.098，P=0.999(>0.05)

2.2 A549細(xì)胞E-cadherin基因甲基化狀態(tài)

A549細(xì)胞中E-cadherin基因甲基化狀態(tài)為部分甲基化，見(jiàn)圖1。

圖1 E-cadherin基因甲基化檢測(cè)(MSP)M為甲基化(117 bp);U為非甲基化(97 bp)

3 討論

尿多酸肽是從健康人尿中經(jīng)酸化、吸附、洗脫、真空干燥等工藝流程制成的非細(xì)胞毒性尿萃取物，含多種有機(jī)酸和分子量小于6000 D的多肽(每100 ml含馬尿酸300 mg，苯乙酰谷氨酰胺300 mg，多肽150 mg，4-羥基苯乙酸50 mg，5-羥基吲哚乙酸10 mg；以馬尿酸含量計(jì)，其濃度為3 mg/ ml)。近年來(lái)，尿多酸肽在抗腫瘤方面的作用逐漸引起人們重視[1]。本實(shí)驗(yàn)選取人肺腺癌A549細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行尿多酸肽的抗腫瘤效應(yīng)研究。在體外實(shí)驗(yàn)中我們采用MTT法檢測(cè)不同濃度尿多酸肽作用下A549細(xì)胞的存活率。MTT結(jié)果顯示尿多酸肽顯著抑制人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著劑量的增加其抑制作用增強(qiáng)。

DNA序列以外的調(diào)控機(jī)制異常，即表觀遺傳學(xué)異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用普遍受到人們重視。表觀遺傳學(xué)包括甲基化狀態(tài)、基因組印跡，染色體修飾，組蛋白修飾及microRNA調(diào)控狀態(tài)等方式，其中甲基化與腫瘤發(fā)生關(guān)系最為密切，它作為表觀遺傳學(xué)的1種調(diào)控機(jī)制是最早被人們發(fā)現(xiàn)的?；騿?dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)的失活是表觀遺傳學(xué)改變的重要方式之一。抑癌基因的失活在腫瘤的發(fā)生中起了重要的作用[2～4]。E-cadherin能抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，被公認(rèn)為是浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的抑制基因。E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-Cad)作為關(guān)鍵的細(xì)胞黏附分子，當(dāng)E-Cad表達(dá)下調(diào)將使同種細(xì)胞失去黏附，正常組織不能發(fā)育成形。對(duì)于惡性腫瘤而言，則細(xì)胞極性喪失、呈現(xiàn)惡性細(xì)胞形態(tài)并具備侵襲性生長(zhǎng)特性[5]。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)人肺腺癌A549細(xì)胞株E-cadherin基因甲基化狀況，結(jié)果A549細(xì)胞株存在E-cadherin基因異常甲基化，呈部分甲基化。

綜上所述，我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)及MSP檢測(cè)初步

證實(shí)了尿多酸肽對(duì)A549細(xì)胞有抑制作用，A549細(xì)胞株存在E-cadherin基因的異常甲基化，為下一步研究尿多酸肽的去甲基化作用打下了基礎(chǔ)。

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