劉 敏，石運(yùn)芝，王黎明

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 山東 青島 266021； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰安醫(yī)院婦科, 山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 山東 泰安 271000； 4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科， 山東 青島 266011)

早期自然流產(chǎn)是指在娠妊12周之前非故意終止的宮內(nèi)妊娠，是臨床常見(jiàn)的病理妊娠之一。在排除母方內(nèi)分泌功能失調(diào)、子宮病變、病原微生物感染、濫用藥物、父方染色體、精液異常等致病因素的情況下，仍有60%～70%妊娠婦女發(fā)生流產(chǎn)，稱(chēng)之為不明原因早期自然流產(chǎn)(early unexplained spontaneous abortion)。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示，不明原因早期自然流產(chǎn)的機(jī)制十分復(fù)雜，可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常有關(guān)[1-4]。本研究擬采用免疫組織化學(xué)SABC法，檢測(cè)抑制凋亡的Bcl-2蛋白和促進(jìn)凋亡的Fas蛋白在早期正常妊娠和自然流產(chǎn)的絨毛及蛻膜組織中的分布和變化規(guī)律，以期進(jìn)一步明確細(xì)胞凋亡在早期自然流產(chǎn)中的病理機(jī)制，并為臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象與分組

收集2009年11月～2009年12月，在泰安市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診要求終止早孕的15例婦女，做為正常妊娠組。自然流產(chǎn)組共20例，為首次不明原因自然流產(chǎn)者。兩組孕婦年齡20～35歲，身體健康，月經(jīng)規(guī)律(月經(jīng)周期28～30 d)，停經(jīng)5～9周，3個(gè)月內(nèi)未使用任何激素類(lèi)藥物，宮頸、陰道無(wú)急性及慢性炎癥，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，無(wú)異常孕育史。

1.2 主要試劑

兔抗人Bcl-2和Fas抗體及輔助試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

兩組均在確診后，負(fù)壓吸宮，取其胎盤(pán)絨毛和蛻膜組織。PBS沖洗后，投入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為6 μm。切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精至水，用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：①3% H2O2中室溫作用10 min，蒸餾水洗；②微波抗原修復(fù)2次；③5%BSA封閉液，室溫20 min；④分別滴加兔抗人Bcl-2(1∶200)和兔抗人Fas(1∶200)，37℃孵育2 h；⑤生物素標(biāo)記的IgG (1∶200), 室溫1 h，緩沖液沖洗；⑥SABC復(fù)合物(1∶200)，室溫1 h；⑦DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定及分析

每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6張切片，光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)視野，陽(yáng)性部位呈棕黃色。并將圖像輸入Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所)，分別測(cè)得各實(shí)驗(yàn)組胎盤(pán)絨毛和蛻膜組織中陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(OD值)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 絨毛和蛻膜組織中Bcl-2免疫組化染色結(jié)果

抑制凋亡的Bcl-2蛋白主要分布于絨毛合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)(圖1、2、3)，且在正常妊娠組的水平顯著高于自然流產(chǎn)組(P﹤0.05)。Bcl-2蛋白在蛻膜細(xì)胞中的水平明顯低于其在滋養(yǎng)層的水平(見(jiàn)表1)。

2.2 絨毛和蛻膜組織中Fas免疫組化染色結(jié)果

促進(jìn)凋亡的Fas蛋白主要分布于絨毛合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)(圖4、5、6)，且在自然流產(chǎn)組的水平顯著高于正常妊娠組(P﹤0.05)。Fas蛋白在蛻膜細(xì)胞中的水平明顯高于其在滋養(yǎng)層的水平(見(jiàn)表1)。

表1 絨毛和蛻膜組織中Bcl-2和Fas免疫反應(yīng)物的平均光密度

注： 與正常妊娠組相比，*P﹤0.05

圖1 Bcl-2蛋白在正常妊娠組絨毛組織中的表達(dá) ×400

圖2 Bcl-2蛋白在自然流產(chǎn)組絨毛組織中的表達(dá) ×200

圖3 Bcl-2蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中的表達(dá) ×200

圖4 Fas蛋白在自然流產(chǎn)組絨毛組織中的表達(dá) ×200

圖5 Fas蛋白在自然流產(chǎn)組蛻膜組織中的表達(dá) ×200

圖6 Fas蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中的表達(dá) ×200

3 討 論

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指一種受細(xì)胞內(nèi)外因素調(diào)控的細(xì)胞自殺性死亡方式，且死亡細(xì)胞從組織中清除的過(guò)程不伴隨炎癥反應(yīng)。凋亡調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)失衡可能是導(dǎo)致各種病理妊娠發(fā)生的重要原因之一。如在感染引起的早產(chǎn)、妊高征及IUGR等妊娠并發(fā)癥中都證實(shí)了細(xì)胞凋亡的作用；有研究證明藥物米非司酮的抗早孕作用也是通過(guò)誘導(dǎo)和促進(jìn)蛻膜及絨毛細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5-9]。

Bcl-2蛋白主要分布于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜，可通過(guò)與細(xì)胞中另一被稱(chēng)作Bax的蛋白相結(jié)合或通過(guò)抗氧化作用或抑制氧化自由基的產(chǎn)生而阻止或減少由各種刺激引起的細(xì)胞凋亡[10，11]。本研究結(jié)果顯示:正常早孕階段絨毛合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞中均有抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)。這與Kim等[12]報(bào)道的Bcl-2蛋白只表達(dá)于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的結(jié)論以及國(guó)內(nèi)滕振娟等[13]和張?jiān)律彽萚14]報(bào)道的Bcl-2蛋白主要分布在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中不表達(dá)的結(jié)論不一致。我們認(rèn)為，國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果的差異可能與取材時(shí)間和具體操作程序的不同有關(guān)。正常早孕階段Bcl-2蛋白的表達(dá)可能在維持合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞的數(shù)量上發(fā)揮重要作用，從而保障早孕絨毛的發(fā)生、發(fā)育、胎盤(pán)形成和為孕卵生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)。不明原因早期自然流產(chǎn)組絨毛滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，繼而發(fā)生自然流產(chǎn)，這與KoKawa等[15]的研究相一致性。

Fas抗原又稱(chēng)Apo-1CD95,屬于腫瘤壞死因子(TNF) /神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNGF)受體超家族成員,是I型跨膜蛋白。Fas通過(guò)與其天然配體Fas-L結(jié)合，可誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果還顯示，促進(jìn)凋亡的Fas蛋白在正常早孕階段絨毛合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞中低表達(dá)，在不明原因早期自然流產(chǎn)組高表達(dá)。這與丁峰等報(bào)道的自然流產(chǎn)蛻膜細(xì)胞Fas mRNA和蛋白表達(dá)的增加相一致[28]。Hammer等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果曾顯示絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)FasL,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)Fas的母體蛻膜白細(xì)胞凋亡,形成母胎免疫豁免區(qū),使胚胎免受母體免疫細(xì)胞損傷[16]。不明原因早期自然流產(chǎn)過(guò)程中，可能由于Fas蛋白在滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞中表達(dá)升高，通過(guò)與Fas-L結(jié)合引起細(xì)胞凋亡增加，使絨毛生長(zhǎng)受阻,蛻膜變性壞死，從而阻礙了人類(lèi)孕卵的發(fā)育, 繼而發(fā)生自然流產(chǎn)。

綜上所述，正常早孕階段存在細(xì)胞凋亡，對(duì)妊娠的順利進(jìn)行有重要作用，但是如果凋亡調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)失衡則會(huì)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。如果能夠明確引起異常凋亡的因素和機(jī)制,進(jìn)而人為地控制這些因素或阻斷其作用途徑，就有可能達(dá)到對(duì)自然流產(chǎn)的預(yù)防和治療作用。

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