高秀秋,石 鐵,杜 暘,李 波

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121001； 2. 遼寧醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科，遼寧 錦州121004)

牙周病是為糖尿病的重要合并癥之一，糖尿病與牙周病之間呈雙向關(guān)系，糖尿病可以增加牙周病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，血糖增高是慢性牙周炎的危險(xiǎn)因素[1]。而血糖的良好控制能促進(jìn)牙周的康復(fù)。了解糖尿病的牙周并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素已成為糖尿病防治工作的重點(diǎn)。研究表明，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在不同時(shí)間和空間的表達(dá)啟動(dòng)、控制著牙周病的形成[2，3]，本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-1β+3953基因多態(tài)性與2型糖尿病伴發(fā)牙周病的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 病例選擇

患者均為遼寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔及內(nèi)分泌科室門診病人， 共 90例，其中男49例，女41例，年齡34～72歲。

糖尿病患者符合以下條件：患者被診斷為2型糖尿病1年以上，血糖水平超過(guò)正常范圍，無(wú)其他嚴(yán)重全身疾病及并發(fā)癥，經(jīng)體檢無(wú)呼吸、消化、泌尿、生殖系統(tǒng)或身體其他部位的炎癥感染，糖尿病狀況及用藥量近期無(wú)明顯變化。

糖尿病患者伴牙周病入選標(biāo)準(zhǔn)：全身情況良好，無(wú)嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥，無(wú)身體其他部位感染；口內(nèi)預(yù)留牙數(shù)不少于15顆；至少有2個(gè)位點(diǎn)附著喪失超過(guò)4 mm，探診深度超過(guò)4 mm；X線顯示多個(gè)位點(diǎn)牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/3；至少半年內(nèi)未接受任何牙周治療。

所有人員均為長(zhǎng)期居住在遼寧地區(qū)的漢族人群，均了解本次試驗(yàn)的目的并簽字同意參與。

1.2 方 法

1.2.1 樣本采集和DNA提?。喝⊙芯繉?duì)象前臂靜脈血 2 mL ,0.5 mol/L EDTA 抗凝,保存 -70℃冷室備用。血樣本抽提DNA，用低滲法破除紅細(xì)胞，在蛋白酶K及SDS的作用下37℃消化過(guò)夜。等體積酚氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀析出基因組DNA溶于TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCI,1 mmol/L EDTA,pH = 8.0)中，4℃保存。用UV-240紫外分光光度自動(dòng)記錄儀測(cè)定DNA樣品在 260 nm 和 280 nm 處的吸光度(A值)，計(jì)算DNA的含量和判斷DNA純度。IL-1β+3953 多態(tài)性目的基因片段擴(kuò)增和酶切分析[4]。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，dNTP 2 μL,10×緩沖液2 μL，BSA 2 μL，順義引物為5′-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA-3′和反義引物為5′-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-3′各0.5 μmol/L，2.5 μmol/L Mg2+1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。循環(huán)參數(shù)94 ℃ 5 min，30×(94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析證實(shí)PCR擴(kuò)增成功，然后取PCR產(chǎn)物5 μL，TaqI限制性內(nèi)切酶3 U，10×酶切緩沖液1 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積至10 μL，混勻，65 ℃水浴過(guò)夜，取酶切產(chǎn)物4 μL作7% PAGE電泳，硝酸銀法染色后讀取結(jié)果，證實(shí)酶切徹底[5]。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，運(yùn)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析處理。檢驗(yàn)水平在P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試人群的性別與年齡情況

受試者年齡范圍為34～72歲(表1),平均年齡為53.32 歲。男性49 名,女性41 名,男女性別所占受試者比率分別為54%和46%.其中37%的受試者在近1年內(nèi)接收過(guò)牙科檢查。糖尿病患者的平均患病年齡為9.4 年。接近93%的受試者平均刷牙1次/d。有3%的受試者有用牙線的習(xí)慣，43%的受試者有飯后用牙簽剔牙習(xí)慣。吸煙或有過(guò)吸煙經(jīng)歷的受試者有27名。有6名受試者在2年內(nèi)有洗牙史。

表1 受試人群的性別與年齡

2.2 受試人群牙周炎情況

對(duì)單純的牙周炎及牙周炎伴發(fā)糖尿病受試者的牙周炎情況進(jìn)行比較，見表2。單純的牙周炎患者中度牙周炎患者所占比率為53.84(n=14/26),牙周炎伴發(fā)糖尿病受試者中中度牙周炎患者所占比率為52.88% (n=11/21)。

表2 受試人群牙周炎程度 n(%)

2．3 基因型測(cè)定電泳結(jié)果

受試者血中提取的PCR產(chǎn)物與TaqI限制性內(nèi)切酶混合過(guò)夜，酶切產(chǎn)物于12%的PAGE凝膠電泳，EtBr染色后讀取結(jié)果。出現(xiàn)3個(gè)酶切片段135 bp，114 bp，249 bp的為I/II基因型，只出現(xiàn)135 bp，114 bp片段的為I/I基因型(圖1)。

圖1 PAGE凝膠電泳圖

2.4 對(duì)所有受試者的IL-1β+3953基因型進(jìn)行分析

牙周健康人群中的IL-1β+3953基因的I/II型的比例占所有健康受試者的5%,而糖尿病與慢性牙周炎的的IL-1β+3953基因的I/II型的比例占同類受試者的8.70%(P<0.05)和11.54%(P<0.05),與健康組進(jìn)行比較,L-1β+3953基因的I/II型的比例增加3.70%和6.54%,這表明IL-1β+3953基因的I/II型與糖尿病及牙周炎的發(fā)生有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性糖尿病伴發(fā)牙周炎的患者的IL-1β+3953基因的I/II型的比例為14.29%(P<0.05) 與健康組進(jìn)行比較,L-1β+3953基因的I/II型的比例增加9.29%,且明顯高于單發(fā)的糖尿病或牙周炎患者,這表明在糖尿病患者具有IL-1β+3953 I/II的基因型會(huì)進(jìn)一步增加牙周炎的患病概率。

表3 IL-8β+3953/Taq基因型在受試者中的分布

1)與健康組相比P<0.05

3 討 論

目前，對(duì)于牙周病的研究已經(jīng)深入到分子生物學(xué)水平，研究發(fā)現(xiàn)牙周病的形成是一個(gè)復(fù)雜的微生物學(xué)、組織學(xué)、生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，是細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、基因及外界因素綜合作用和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果[6，7]。一項(xiàng)研究結(jié)果表明[8],在2型糖尿病情況下,高血糖與IL-1β的升高有著密切的聯(lián)系,在2型糖尿病患者發(fā)生某些器官的感染時(shí),會(huì)釋放大量的免疫因子,包括IL-1β和腫瘤壞死因子.在IL-1β的基因型多樣性存在情況下,會(huì)促使IL-1β誘導(dǎo)的某些細(xì)胞因子分泌增加。糖尿病患者在IL-1A基因多態(tài)型存在可以使牙周炎的患病幾率增加3倍。另外有報(bào)道提出[9],2型糖尿病的患者對(duì)血液中的細(xì)胞因子的易感性明顯增加。這也就解釋了在糖尿病患者在具有IL-1β+3953I/II型基因時(shí)導(dǎo)致患牙周炎的幾率增加。

本研究顯示，IL-1β+3953等位基因II型的存在與牙周炎及糖尿病的發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在糖尿病患者中具有IL-1β+3953等位基因II的人群伴發(fā)牙周炎的概率明顯增高。因此 ，分析IL-1β+3953等位基因與2型糖尿病伴發(fā)牙周病的相關(guān)關(guān)系，尋找和建立有效的糖尿病合并牙周炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和發(fā)病前診斷技術(shù)，在臨床上具有重要實(shí)用價(jià)值，這對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)防治糖尿病合并牙周炎有著十分積極的臨床意義。

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