苗迎秋，李 志，高文倉(cāng)

(1.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，遼寧 大連 116622；2.大連市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116033；3.大連大學(xué) 新華醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116021)

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,其治療方法主要有手術(shù)和化療。由于卵巢癌發(fā)病隱匿,約70%患者確診時(shí)已為晚期。對(duì)多數(shù)晚期患者臨床主要采用化學(xué)療法 ,但總的來說療效不理想 ,其中重要原因之一是卵巢癌患者對(duì)化療產(chǎn)生抗藥性[1]。由于化療耐藥致使晚期患者的5 年生存率僅為30%[2]，卵巢癌耐藥的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)機(jī)制是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外婦產(chǎn)科學(xué)界極其緊迫的研究課題。對(duì)卵巢癌耐藥機(jī)制進(jìn)行探討,不僅有利于更深入地了解疾病的發(fā)生發(fā)展,更有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇合理的化療方案和化療藥物，采取針對(duì)性的治療措施來逆轉(zhuǎn)耐藥,提高卵巢癌患者的生存率。建立理想的卵巢癌耐藥細(xì)胞模型是深入研究卵巢癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的前提。在眾多抗癌藥中,阿霉素(ADR)是最具有代表性的藥物。它可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。由于 ADR抗藥可作為多藥耐藥(MDR)的典型代表，ADR的耐藥特點(diǎn)也是MDR的全部特點(diǎn)[3]，所以，本研究對(duì)誘導(dǎo)建立具有多藥耐藥表型的卵巢癌耐藥株(SK-OV-3/adr)[4]，繼續(xù)用大劑量ADR反復(fù)沖擊用藥,并對(duì)誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞中mdr1/P-gp的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 卵巢癌敏感細(xì)胞株(SK-OV-3)：由吉林省腫瘤研究所提供。

1.1.2 試劑:RPMI1640培養(yǎng)液Gibco/BRL公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) 和DMSO均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清；TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitr ogen公司。RT-PCR試劑盒、DNA聚合酶、DNA Marker、瓊脂糖購(gòu)自TaKaRa公司。多藥耐藥相關(guān)基因-1(mdr1)、β-actin引物購(gòu)于大連寶生物工程有限公司,鼠抗人 P-gp單克隆抗體、生物素標(biāo)記的抗體 (二抗 )、辣根過氧化物酶均購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥品:阿霉素(ADR 浙江海正藥業(yè))；足葉乙甙(VP-16 貴州漢方制藥)；長(zhǎng)春新堿(VCR 廣州白云山明興制藥)、紫杉醇(PTX貴州漢方制藥)、逆轉(zhuǎn)劑鹽酸維拉帕米(Ver 新華醫(yī)院腫瘤科提供)。

1.1.4 儀器:熒光分光光度計(jì)(960型)為上海三科儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Sunrise Remote)為TECAN產(chǎn)品；熒光顯微鏡(BX51TRF)為OLYMPUS產(chǎn)品；RT-PCR儀(TC512)為TECHNE產(chǎn)品。

1.2 方 法

1．2．1 卵巢癌耐藥細(xì)胞株SK-OV-3/adr的建立：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期SK-OV-3細(xì)胞2×106個(gè)接種到含10 mL RPMI1640完全培養(yǎng)基的平皿中，置5 %CO2、相度濕度90%、溫度37℃的培養(yǎng)箱中,24 h后細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。先以終濃度為53.4 ng/mL的ADR培養(yǎng)液沖擊細(xì)胞，72 h后棄含藥培養(yǎng)液,PBS洗3遍,換新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液，2 d換液1次，洗去死亡細(xì)胞，待形成細(xì)胞克隆時(shí)傳代,恢復(fù)穩(wěn)定生長(zhǎng)再提高ADR濃度。如此反復(fù)，間歇給藥直至細(xì)胞可在濃度為15 ng/mL的ADR培養(yǎng)液中維持培養(yǎng)，初步建立了具有多藥耐藥表型的SK-OV-3/adr細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上，作者分別以160 ng/mL、310 ng/mL、 630 ng/mL、 1250 ng/mL的ADR反復(fù)3次作用細(xì)胞后，再用10 μg/mL ADR作用1 h后,消化傳代細(xì)胞至恢復(fù)健康后，換至含310 ng/mL的ADR培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，如上法反復(fù)沖擊用藥，最終獲得的SK-OV-3/adr細(xì)胞株脫離ADR 2周后，采用MTT法測(cè)定SK-OV-3/adr細(xì)胞株對(duì)mdr1/P-gp主要底物ADR、VP-16、VCR、PTX 4種抗癌劑以及加逆轉(zhuǎn)劑Ver后的細(xì)胞半數(shù)致死濃度(IC50)、耐藥指數(shù)RI(藥物對(duì)SK-OV-3細(xì)胞IC50/藥物對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞IC50)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(藥物對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞逆轉(zhuǎn)前IC50/藥物對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞逆轉(zhuǎn)后IC50)。

1．2．2 熒光顯微鏡觀察不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)的藥物含量變化：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期SK-OV-3及SK-OV-3/adr細(xì)胞株以5×105個(gè)/孔的濃度接種到放有滅菌蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，置5% CO2、相度濕度90%、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，每孔換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基1 mL，并加入10 mg/mL ADR 1 μL，分別在30、60、120 min后，用預(yù)冷的PBS洗3次，撈取細(xì)胞爬片，甘油封片， 熒光顯微鏡下觀察。

1．2．3 細(xì)胞內(nèi)ADR含量的測(cè)定[5]：藥物濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以0.3 N鹽酸的50 %乙醇配制不同濃度的 ADR,根據(jù) ADR具有自發(fā)熒光的特點(diǎn) ,從熒光分光光度計(jì)上測(cè)定相應(yīng)濃度ADR的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)λ= 470 nm ,發(fā)射波長(zhǎng)λ= 585 nm ,狹縫寬8 nm) 。根據(jù)藥物濃度-熒光強(qiáng)度繪制曲線作為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-OV-3及SK-OV-3/adr細(xì)胞株以1×106個(gè)/孔的濃度接種到24孔培養(yǎng)板中，置5 %CO2、相度濕度90 %、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中,24 h后待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，每孔換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基1 mL，分別加入10 mg/mL ADR 10 μL、 ADR(10 mg/mL) + Ver(5 mg/mL)混合液10 μL，孵育30、60、120 min后，用預(yù)冷的PBS洗3次，收獲細(xì)胞，重新懸浮于0.3 N鹽酸的50 %乙醇中消化4 ℃過夜。次日離心，取上清于熒光分光光度計(jì)上測(cè)定熒光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)ADR相應(yīng)的濃度。

1．2．4 RT-PCR法檢測(cè)耐藥細(xì)胞系與非耐藥細(xì)胞系mdr1基因的表達(dá)：總RNA 提取:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-OV-3及SK-OV-3/adr細(xì)胞用 Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA,然后用RT-PCR試劑盒采用二步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,檢測(cè)mdr1表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min ,94 ℃ 變性 40 s ,退火溫度 55 ℃,退火30 s ,72 ℃延伸 30 s ,共進(jìn)行 45個(gè)循環(huán) ,72 ℃再延伸4 min。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6],mdr1上游引物:5’-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG - 3’,下游引物:5’-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA - 3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度157 bp。用2 %瓊脂糖電泳觀察 PCR產(chǎn)物 ,以β-action為內(nèi)參基因。

1．2．5 Western blot法檢測(cè)耐藥細(xì)胞系與非耐藥細(xì)胞系P-gp蛋白的表達(dá)[6]：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-OV-3及SK-OV-3/adr細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液(終濃度為2 μg/mL)在冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定含量。取含20 μg蛋白樣品于8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下封閉1 h，用含0.05 % Tween20的TTBS緩沖液(tris-buffered saline Tween20,TTBS)洗膜3次，加入相應(yīng)的鼠抗人單克隆抗體(用封閉液1∶1000稀釋)，4℃培育過夜，TTBS漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗(用封閉液1∶500)，37℃培育1 h，以GAPDH為內(nèi)參，采用辣根過氧化物酶-增強(qiáng)發(fā)光顯示系統(tǒng)顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析成像。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料輸入計(jì)算機(jī)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，IC50用線性回歸法。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞株的IC50、計(jì)算耐藥指數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

2.1.1 不同抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞株的IC50及耐藥指數(shù)測(cè)得的結(jié)果：經(jīng)MTT比色法測(cè)定，P-gp主要底物ADR、VP-16、PTX、VCR對(duì)誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr的IC50均有明顯增加，見表1。

表1 不同抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr的IC50和測(cè)得的RI

SK-OV-3/adr vs SK-OV-3，P<0.01

2.1.2 Ver逆轉(zhuǎn)后不同抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞株的IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)測(cè)得的結(jié)果： P-gp主要逆轉(zhuǎn)劑Ver作用SK-OV-3/adr細(xì)胞后，經(jīng)MTT比色法檢測(cè)，與逆轉(zhuǎn)前相比P-gp主要底物ADR、VP-16、PTX、VCR對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞的IC50均有明顯降低，加Ver后不同抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr的IC50和測(cè)得的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，見表2。

表2加Ver后不同抗癌劑對(duì)SK-OV-3/adr的IC50和測(cè)得的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

DrugsIC50(ng/mL)SK-OV-3/adr+Ver逆轉(zhuǎn)倍數(shù)ADR3115.6±2.51)151.9±3.22)20.5VP-1680000.0±3.61)7053.4±2.42)11.3PTX14035.2±8.51)776.7±10.22)18.1VCR31188.6±3.01)466.4±20.02)66.9

逆轉(zhuǎn)前vs逆轉(zhuǎn)后，P<0.01

2.2 熒光顯微鏡觀察不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)的ADR含量變化

加入10 mg/mL ADR 1 μL，在30、60、120 min后，結(jié)果顯示在敏感株SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)，ADR的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而加強(qiáng)，且集中分布在細(xì)胞的核區(qū)；耐藥株SK-OV-3/adr細(xì)胞內(nèi)ADR的熒光強(qiáng)度在3個(gè)時(shí)間段未見有明顯變化，ADR在核區(qū)分布明顯減少，相對(duì)在胞質(zhì)中增多(見圖1)。

圖1熒光顯微鏡下觀察不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)ADR的熒光強(qiáng)度

2.3 熒光分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADR濃度的結(jié)果

2.3.1 已知濃度ADR熒光強(qiáng)度的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的ADR與相應(yīng)熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系為良好的線性關(guān)系(見圖2)。

圖2 不同濃度的ADR與相應(yīng)熒光強(qiáng)度之間線性關(guān)系

2.3.2 細(xì)胞內(nèi)藥物含量的測(cè)定:敏感株SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)ADR平均濃度明顯高于耐藥株SK-OV-3/adr細(xì)胞(P<0.01)，30、60、120 min ADR含量分別是耐藥株SK-OV-3/adr的3.7、5.9、8.6倍，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯的增加。當(dāng)加入非細(xì)胞毒性劑量的Ver后,SK-OV-3/adr細(xì)胞內(nèi)ADR平均濃度與逆轉(zhuǎn)前相比明顯升高 (P<0.01),并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。在SK-OV-3細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)前、后，細(xì)胞內(nèi) ADR平均濃度都隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高，二者相比差異無顯著性意義(P>0.05)，見表3。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞mdr1基因的表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ADR 誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr細(xì)胞 mdr1呈陽(yáng)性表達(dá)，而SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)mdr1未見表達(dá)，見圖3。

表3 不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)藥物含量的測(cè)定

1) SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)ADR的含量；2)Ver干預(yù)后SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)ADR的含量；3)SK-OV-3/adr細(xì)胞內(nèi)ADR的含量；4) Ver干預(yù)后SK-OV-3/adr細(xì)胞內(nèi)ADR的含量(P<0.01，SK-OV-3 vs SK-OV-3/adr、SK-OV-3/adr逆轉(zhuǎn)前 vs SK-OV-3/adr逆轉(zhuǎn)后；P>0.05，SK-OV-3逆轉(zhuǎn)前 vs SK-OV-3逆轉(zhuǎn)后)

圖3 ADR誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr和SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)mdr1的測(cè)定結(jié)果

2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADR 誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr細(xì)胞 P-gp呈陽(yáng)性表達(dá)，而SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)P-gp未見表達(dá)，見圖4。

圖4 ADR誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr和SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)P-gp的測(cè)定結(jié)果

3 討 論

目前,對(duì)ADR耐藥的研究多采用濃度梯度遞增法和高濃度間歇沖擊法在體外誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株。前者存在忽視了耐藥性較低的缺點(diǎn)，而后者則容易引起細(xì)胞死亡而使實(shí)驗(yàn)中斷。臨床及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),不同藥物引起的耐藥機(jī)制不一致,而且同一腫瘤在治療的不同階段，其耐藥機(jī)制也不一致；同一種腫瘤細(xì)胞,用同一種藥物誘導(dǎo),誘導(dǎo)藥物終濃度相同,不同的誘導(dǎo)方法可得到耐藥機(jī)理不同的耐藥細(xì)胞株[7]。本研究首先采用較大劑量的ADR間歇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行篩選，再采用藥物濃度梯度遞增法建立具有多藥耐藥表型的SK-OV-3/adr細(xì)胞株[4]，其后與大劑量ADR反復(fù)沖擊用藥法相結(jié)合繼續(xù)誘導(dǎo)，結(jié)果顯示三種方法相結(jié)合誘導(dǎo)的細(xì)胞株仍對(duì)P-gp主要底物 ADR、VCR、PTX、VP16的耐藥倍數(shù)大幅度提高，用P-gp的主要競(jìng)爭(zhēng)底物Ver逆轉(zhuǎn)后各藥物對(duì)SK-OV-3/adr細(xì)胞株的IC50明顯降低，提示此三種方法相結(jié)合誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株耐藥機(jī)制可能仍與P-gp有關(guān)系。

目前，普遍認(rèn)為多藥耐藥基因mdr1及其編碼的P-gp過度表達(dá)是產(chǎn)生MDR的主要機(jī)制之一。P -gp相對(duì)分子量為 170 kD，屬于腺苷三磷酸結(jié)合蛋白超家族成員,為能量依賴型藥泵,具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征，在耐藥細(xì)胞膜上過度表達(dá)，能將多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的天然藥物如紫杉醇、阿霉素等藥物自細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)蓄積濃度下降,細(xì)胞內(nèi)化療藥物達(dá)不到有效殺傷劑量而致耐藥性產(chǎn)生[8]。近年來，藥物在細(xì)胞內(nèi)的異常分布及其與耐藥機(jī)制的關(guān)系也日漸引起人們的重視。Maralai等[9]研究表明，在MDR細(xì)胞中，P-gp在細(xì)胞核上的表達(dá)是阻止藥物進(jìn)入核區(qū)的直接原因。本研究亦發(fā)現(xiàn)利用ADR本身固有的熒光，采用熒光顯微鏡觀察ADR在細(xì)胞中的分布，結(jié)果顯示在SK-OV-3細(xì)胞中，阿霉素集中分布在細(xì)胞的核區(qū)， 而在耐藥株SK-OV-3/adr中，核區(qū)分布明顯減少，相對(duì)在胞質(zhì)中增多，這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[10]。這種異常分布使得阿霉素在耐藥細(xì)胞內(nèi)遠(yuǎn)離作用靶點(diǎn)細(xì)胞核，不能發(fā)揮抗癌作用，從而構(gòu)成耐藥性的一個(gè)原因。用熒光分光光度法檢測(cè)SK-OV-3/adr細(xì)胞內(nèi) ADR含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)無改變，在30 min后基本達(dá)到平衡。加入Ver后，細(xì)胞內(nèi)ADR含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；而SK-OV-3細(xì)胞中ADR含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，提示細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少可能是SK-OV-3/adr產(chǎn)生多藥耐藥性的主要機(jī)制。分析原因，可能是膜通透性改變致細(xì)胞對(duì)藥物攝入減少或細(xì)胞內(nèi)藥物外流增加的結(jié)果。

許多研究表明，mdr1/P-gp與病人治療結(jié)果密切相關(guān)。mdr1陽(yáng)性病人生存期短，緩解率低，復(fù)發(fā)率高。因此，mdr1/P-gp的分析可作為癌癥治療結(jié)果的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2]，也是臨床醫(yī)生制定治療方案的參考依據(jù)。還有研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤未見陽(yáng)性表達(dá)，但在化療或復(fù)發(fā)者P-gp陽(yáng)性表達(dá)率增加，認(rèn)為P-gp在介導(dǎo)化療藥物誘導(dǎo)的獲得性多藥耐藥方面發(fā)揮著重要作用[11]。因此，探討mdr1/P-gp在卵巢細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制中的作用有其重要意義。本研究通過RT-PCR和Westernblot的測(cè)定結(jié)果顯示SK-OV-3/adr細(xì)胞中mdr1/P-gp都呈陽(yáng)性表達(dá)，而在SK-OV-3細(xì)胞中未見表達(dá)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了mdr1/P-gp在本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的SK-OV-3/adr細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制起主要作用，為更進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制和臨床腫瘤治療合理地選擇化療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 童英，潘凌亞,周生,等.多藥耐藥基因反義寡脫氧核苷酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)的作用[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2000,35(11):677-6791.

[2] 馬丁.卵巢癌多藥耐藥機(jī)制的探討[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志,2007,8(3):184-188.

[3] 劉岳彪,吳德政.阿霉素耐藥與谷甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶[J].腫瘤,1994,14(2):17.

[4] 苗迎秋，張文玲，王曼麗，等.阿霉素誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞耐藥株的建立及多藥耐藥表型測(cè)定[J] .大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(3):258-261.

[5] 胡軍,金偉,楊佩滿.β-欖香稀逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF27/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性的研究[J].中華腫瘤雜志,2004,26(5):268-270.

[6] 高娜,張育,茆俊卿.某些中藥對(duì)K562 /A02細(xì)胞Mdr基因及其表達(dá)產(chǎn)物的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(4):785-789.

[7] Yang LY,Trujillo JM.Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two methods[J].Cancer Res，1990，50:321.

[8] 黎丹戎,張瑋.黃芩素對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/ADM逆轉(zhuǎn)作用實(shí)驗(yàn)研究[J].腫瘤,2004,24(2):111-113.

[9] Maraldi NM,Zini N,Santi S,et al.P-glycoprotein subcellular localization and cell morphotype in MDR1 gene-transfected human osteosarcoma cells [J].Biol Cell,1999,91(1):17-28.

[10] 馬強(qiáng)，張振書.阿霉素在耐藥株LoVo/Adr細(xì)胞內(nèi)的攝入及分布特點(diǎn)[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(3):264-266.

[11] 張樹榮.卵巢癌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2006，22(3)：148-150.