白 亮，李耀輝，王 如

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔頜面外科，遼寧 大連 116011)

抗癌藥物對(duì)腫瘤產(chǎn)生的效果不僅依賴于對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制，同時(shí)依賴于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。評(píng)價(jià)抗癌藥物療效的重要標(biāo)志是能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。大量研究表明，姜黃素能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如食管癌、鼻咽癌等有誘導(dǎo)其凋亡的細(xì)胞毒作用。姜黃素一方面有一定抗腫瘤作用，另一方面也能通過抗氧化機(jī)制保護(hù)正常細(xì)胞，可降低β-欖香稀的細(xì)胞毒作用。作者通過實(shí)驗(yàn)探討姜黃素聯(lián)合β-欖香稀抑制涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)細(xì)胞株SACC-LM細(xì)胞是否有協(xié)同效應(yīng)，能否誘導(dǎo)其凋亡，并對(duì)凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期阻滯關(guān)系進(jìn)行研究。既往國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有大量研究報(bào)道，但姜黃素協(xié)同β-欖香稀抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-LM細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的研究鮮有報(bào)道。

1 材料和方法

1．1 研究材料

姜黃素：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；5%β-欖香稀乳劑：大連藥物化學(xué)研究提供；SACC-LM：北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院提供；Caspase-3鼠IgG和即用型SABC染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)070206)

1．2 研究方法

1．2．1 藥物敏感性MTT測(cè)定法：將指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞按每孔1×104個(gè)(1 mL)SACC-LM細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中24 h后，分別加入姜黃素、β-欖香稀及姜黃素聯(lián)合β-欖香稀(濃度比1∶1)3組不同用藥，每組藥物分別以0、10、20、40、80、160 μg/mL的濃度順次加藥，對(duì)照組加不含藥物的培養(yǎng)液，孵育24 h，棄上清液，每孔加含0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL溫育1 h，棄上清液，加溶解液100 μL溫育0.5 h，搖勻后，用酶標(biāo)儀在595 nm/630 nm波長(zhǎng)測(cè)定，求A值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值×100%

1．2．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：?jiǎn)为?dú)加10 μg/mL姜黃素、單獨(dú)加10 μg/mL β-欖香稀、10 μg/mL姜黃素和10 μg/mL β-欖香稀聯(lián)合用藥，作用于SACC-LM細(xì)胞24 h，對(duì)照組不加藥的SACC-LM細(xì)胞培養(yǎng)24 h，共4組細(xì)胞。1000 r/min離心5 min，制成1×106個(gè)/mL懸液。取細(xì)胞懸液PBS漂洗2次，70%預(yù)冷乙醇固定，4℃ 2 h。制成200 μL細(xì)胞懸液，加Rnase 100 μL 37℃水浴30 min。加碘化丙啶，15 min后，上機(jī)分析(Facs Vantange SE)。

1．2．3 藥物對(duì)SACC-LM細(xì)胞株Caspase-3表達(dá)的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將其濃度調(diào)整為2.5×103/mL，接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，貼壁后加入不同組的藥物溶液，使其終濃度為10 μg/mL,常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，用4%聚乙二醇固定，按照試劑盒方法進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)。顯微鏡下觀察：每張涂片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)260～460個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)Caspase-3免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和陰性細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．2．4 透射電鏡觀察：不加藥的SACC-LM細(xì)胞培養(yǎng)24 h后作對(duì)照組，以10 μg/mL姜黃素和10 μg/mL β-欖香稀聯(lián)合用藥作用于SACC-LM細(xì)胞24 h為實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)漂洗、固定、脫水、包埋等制成電鏡標(biāo)本，雙鉛染色后，透射電鏡觀察并攝片。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單因素方差分析比較各組差異，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算各組半數(shù)抑制濃度(IC50)及95%可信區(qū)間，依據(jù)95%可信區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷，繪制姜黃素、β-欖香稀，以及姜黃素聯(lián)合β-欖香稀作用SACC-LM細(xì)胞的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線圖。

2 結(jié) 果

2．1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

姜黃素聯(lián)合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細(xì)胞株，與兩種藥物單獨(dú)作用于SACC-LM細(xì)胞株相比，呈現(xiàn)出明顯協(xié)同作用。按Bliss法先測(cè)出姜黃素和β-欖香稀各自IC50；設(shè)其為相加作用，公式：1/混合物預(yù)期IC50=a/姜黃素IC50+b/β-欖香稀IC50，且a+b=1，a=b=0.5。單獨(dú)以姜黃素、β-欖香稀作用于SACC-LM細(xì)胞各自IC50的95%可信區(qū)間和姜黃素聯(lián)合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細(xì)胞的IC50的95%可信區(qū)間不重疊，證明它們之間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1。在聯(lián)合作用SACC-LM細(xì)胞中，1/混合物預(yù)期IC50=0.5/69.45+0.5/186.81?；旌衔镱A(yù)期IC50=101.4?；旌衔镱A(yù)期IC50/實(shí)測(cè)IC50=101.4/30.47=3.32>2.5。證明姜黃素聯(lián)合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細(xì)胞有協(xié)同作用。

表1姜黃素、β-欖香稀及它們聯(lián)合用藥對(duì)SACC-LM細(xì)胞毒性(IC50)μg/mL的影響

類別實(shí)測(cè)IC5095%可信區(qū)間姜黃素69.4558.34～89.51β-欖香稀186.81148.12～240.23聯(lián)合用藥1∶130.4724.87～37.65

時(shí)間相同，不同藥物直接作用于SACC-LM細(xì)胞后，細(xì)胞均出現(xiàn)體積變小、變形，甚至發(fā)泡、皺縮等變化。而聯(lián)合用藥(濃度比1∶1)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其抑制率隨藥物濃度增加而增大，具有濃度依賴性，并繪制其藥物的量效關(guān)系曲線。見圖1。

圖1姜黃素/β-欖香稀/聯(lián)合用藥(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細(xì)胞株的量效關(guān)系曲線

2．2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

對(duì)照組不加藥的SACC-LM細(xì)胞24 h后，G1期細(xì)胞比例74.87%，G2期細(xì)胞比例9.36%，S期細(xì)胞比例15.77%。

單獨(dú)加姜黃素后，G1期細(xì)胞比例40.89%，G2期細(xì)胞比例為36.39%，S期細(xì)胞比例22.73%，凋亡率10.53%，細(xì)胞阻滯在G2/m期。

單獨(dú)加β-欖香稀后，G1期細(xì)胞比例53.93%，G2期細(xì)胞比例0.06%，S期細(xì)胞比例46.01%，凋亡率13.54%，細(xì)胞阻滯在S期。協(xié)同作用后，G1期細(xì)胞比例33.57%，G2期細(xì)胞比例0.00%，S期細(xì)胞比例66.43%，凋亡率26.57%，細(xì)胞阻滯在S期，凋亡率明顯提高，見圖2。

2．3 不同藥物對(duì)SACC-LM細(xì)胞株Caspase-3表達(dá)的影響

經(jīng)不同組藥物(藥物濃度10 μg/mL)處理過的SACC-LM細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞核染為藍(lán)色，其陽(yáng)性表達(dá)都比對(duì)照組高，差異有顯著性意義(P<0.05)，而以聯(lián)合用藥組陽(yáng)性表達(dá)最高，見表2。

組 別陽(yáng)性率(%)陰性對(duì)照組2.9±0.3β-欖香稀組20.8±2.1姜黃素組14.1±1.5姜黃素+β-欖香稀組46.2±3.2

2．4 透射電鏡觀察

對(duì)照組細(xì)胞完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，核仁大而明顯。聯(lián)合用藥組，細(xì)胞皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)高度凝集，核染色質(zhì)沿核膜發(fā)生邊聚，線粒體固縮或腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂，有凋亡樣壞死改變。見圖3、4。

3 討 論

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗HIV病毒等多種藥理作用，是一種天然植物活性成分[1]。β-欖香稀是從中藥莪術(shù)中提取的揮發(fā)油，對(duì)肝、腎功能無損害，毒副作用小。本實(shí)驗(yàn)3組藥物姜黃素組、β-欖香稀組以及兩者聯(lián)合組均有抑制SACC-LM細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但聯(lián)合組抑制率最高。當(dāng)達(dá)到半數(shù)抑制率IC50時(shí)，姜黃素濃度(69.45 μg/mL)是協(xié)同用藥濃度(30.47 μg/mL)的2.27倍，β-欖香稀濃度(186.81 μg/mL)是協(xié)同用藥濃度(30.47 μg/mL)的6.13倍，說明在較高的濃度時(shí)，各組藥物主要通過直接殺死腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤生長(zhǎng)，而聯(lián)合用藥組在較低的劑量下，也能顯示較強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，說明兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)，有協(xié)同作用。

臨床腫瘤學(xué)中，通常以S期細(xì)胞比例作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標(biāo)，在G1期，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)合成，但DNA含量仍保持二倍體；進(jìn)入S期后，DNA開始合成，此時(shí)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量介于G1期和G2期之間，DNA仍未復(fù)制成四倍體。本實(shí)驗(yàn)的可能機(jī)制為：聯(lián)合用藥(濃度比1∶1)作用SACC-LM細(xì)胞時(shí)，使姜黃素與β-欖香稀各自單獨(dú)作用SACC-LM細(xì)胞株的細(xì)胞阻滯周期發(fā)生改變，并使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在S期，抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，并有明顯增高的凋亡率，說明聯(lián)合作用可產(chǎn)生較早期細(xì)胞凋亡。聯(lián)合用藥組Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有顯著性意義，活化的Caspase-3酶是早期細(xì)胞凋亡檢測(cè)的信號(hào)分子，聯(lián)合用藥組可激活Caspase-3，使Caspase-3表達(dá)明顯高于每個(gè)單獨(dú)用藥組，一旦依賴于Caspase-3的細(xì)胞水解過程被激活并啟動(dòng)，細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)，同時(shí)裂解多聚苷核糖聚合酶和Caspase活化的脫氧核糖核酸酶抑制劑，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂，即發(fā)生明顯凋亡。其結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞DNA片斷化出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞DNA正發(fā)生斷裂，細(xì)胞DNA未復(fù)制成四倍體前，發(fā)生S期細(xì)胞阻滯，凋亡率明顯提高的結(jié)果一致，也與電鏡顯示聯(lián)合用藥作用SACC-LM細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)一致。

Caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細(xì)胞凋亡的抑制物(如bcl-2)；水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等。所以，聯(lián)合用藥組同時(shí)使bcl-2凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)下調(diào)，bcl-2基因降低可提高細(xì)胞對(duì)協(xié)同用藥的敏感性，采用Caspase-3表達(dá)技術(shù)，更證實(shí)了聯(lián)合用藥是通過激活Caspase-3和下調(diào)bcl-2調(diào)控蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，也說明兩種藥物有協(xié)同作用。

姜黃素的藥理作用還有抑制氧自由基產(chǎn)生、抑制多種蛋白激酶活性等[2]。其毒副作用小，無明顯的肝腎毒性，故而成為許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究對(duì)象。楊甫文等[3]報(bào)道，姜黃素的抗腫瘤作用機(jī)制在不同腫瘤細(xì)胞中可表達(dá)為抑制腫瘤血管生成，抑制多種酶和蛋白的活性，涉及多種基因的表達(dá)和傳導(dǎo)路徑。而Liu等[4]采用MTT測(cè)定法和免疫組化等技術(shù)研究報(bào)道，姜黃素可抑制Raji淋巴瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能和上調(diào)組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶4蛋白表達(dá)等因素有關(guān)。又有Lim等[5]研究表明，姜黃素可通過上調(diào)抑癌基因p21、p53表達(dá)，抑制原癌基因MDM2,AP1等的表達(dá)。

圖3 對(duì)照組 透射電鏡×5000

圖4 聯(lián)合用藥組 透射電鏡×10000

姜黃素抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，多靶點(diǎn)、多途徑作用是其亮點(diǎn)。姜黃素與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是目前化學(xué)預(yù)防和治療腫瘤研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)姜黃素和β-欖香稀聯(lián)合抑制SACC-LM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的協(xié)同作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。姜黃素具有低毒、價(jià)低、來源廣等優(yōu)點(diǎn)，而β-欖香稀可從資源豐富的天然藥物中尋求，較低濃度的姜黃素與β-欖香稀協(xié)同用藥即可達(dá)到較高抑制腫瘤細(xì)胞SACC-LM生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡的作用。從另一側(cè)面反應(yīng)，降低了β-欖香稀用藥濃度，良好地發(fā)揮了姜黃素保護(hù)正常細(xì)胞的抗氧化機(jī)制。既達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，又避免了高濃度的姜黃素和高濃度的β-欖香稀對(duì)正常組織細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。本實(shí)驗(yàn)是前期實(shí)驗(yàn)的延續(xù)，選擇涎腺腺樣囊性癌SACC細(xì)胞系的不同細(xì)胞株SACC-LM進(jìn)行研究，為臨床上防治涎腺腺樣囊性癌的進(jìn)一步研究提供良好的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于涎腺腺樣囊性癌具有嗜神經(jīng)、嗜血管性等生物學(xué)行為，化療在預(yù)防該腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中有重要地位。希望通過不斷的研究與探索，并摸索出成熟的化療方案，以促進(jìn)臨床在治療涎腺腺樣囊性癌的措施方面有新的突破。

[1] Aggarwal S,Ichikawa H,Takada Y.Curcumin (diferuloylmethane)down-regulates expression of cell proliferation of Ikappabalpha kinase and Akt activation[J]. Mol Pharmacol,2006,69(1)：195-206.

[2] 許東輝，王勝，金晶，等.姜黃素的藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2005，36(11)：1737-1740.

[3] 楊甫文，黃金中.姜黃素抗腫瘤研究機(jī)制進(jìn)展[J]. 福州總醫(yī)院學(xué)報(bào)，2006，13(4)：248-251.

[4] Liu HL,Chen Y,Cui GH,et al. Curcumin,a potent antitumor reagent,is a novel histone deacetylase inhibitor regulating B-NHL cell line Raji proliferation[J].Acta Pharmacol Sin,2005,26(5):603-609.

[5] Lim,Zhang Z,Hill DL,et al. Curcumin,a dietary component,has anticancer,chemosensitization,and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mToR/ETS2 pathway[J].Cancer Res,2007,67(5):1988-1996.