張寶璟，張廣元，甄宇紅，于振龍，黃珊珊，馬驍馳，刁云鵬，舒曉宏

(1.大連醫(yī)科大學 藥物化學教研室，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學 藥學院 2007級學生，遼寧 大連 116044)

蘆丁 (Rutin)，又名蕓香苷 (5,7,3′,4′,-四羥基-3-蕓香糖黃酮)，為廣泛存在于多種藥用植物及食物中的黃酮類化合物，其中以槐花米中含量為高，產(chǎn)率一般可達10%以上。蘆丁及其衍生物具有降血壓、降血脂、抗過敏及抗炎等多種生理活性[1,2]，在臨床上應(yīng)用廣泛。目前，實驗室對蘆丁的提取方法通常采用的有堿提取酸沉淀法、連續(xù)回流提取法、乙醇浸漬法、滲漉法等。其中，以堿提酸沉法使用最多[3]。

近年來超聲提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取方面得到廣泛應(yīng)用，超聲波通過溶液介質(zhì)引起的空化作用，能夠加速藥材中有效成分的溶出，從而提高藥物有效成分的提取效率，成為一種天然藥物有效成分提取的新方法[4]。關(guān)于超聲法從槐花米中提取蘆丁雖有報道[5]，但對于超聲操作方法闡述不一。鑒于此，本研究在傳統(tǒng)堿提酸沉法[3]基礎(chǔ)上，將槐花米粉碎至不同的粒度及超聲提取不同的時間，觀察藥材粉碎度及超聲時間對蘆丁提取效率的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

RT-08高速粉碎機，北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C型酸度計，上海雷磁儀器廠；FA1004型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配有Waters 1525二元泵及2487雙波長紫外檢測器；Inertsil ODS-3 C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，日本島津公司。

槐花米，購自大連美羅大藥房；蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號：0080-9705)；甲醇 (色譜純，F(xiàn)isher Sci, USA)；磷酸、乙醇、濃鹽酸、氧化鈣及硼砂均為分析純，購自天津市博迪化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐花米細粉制備：稱取槐花米藥材，干燥后用粉碎機粉碎，收集經(jīng)過分別經(jīng)過1號篩、3號篩及5號篩的粉末，連同槐花米粗粉(未通過1號篩)各稱取20 g 進行超聲提取。

1.2.2 超聲輔助提取法：將槐花米粉末，每份20 g，加入蒸餾水300 mL，再加入硼砂1 g，石灰乳調(diào)至pH 9[3]，分別超聲(150 W、40 KHz、70℃)2、5、10、20、30、60 min，抽濾[4]?；厥粘闉V所得殘渣，重復以上操作1次。合并濾液，在室溫下用濃HCl調(diào)至pH3[3]，放置過夜。抽濾后得蘆丁粗品，置恒溫干燥箱中干燥，稱重。然后用蒸餾水按1g∶200 mL的比例進行重結(jié)晶，放置過夜，濾取沉淀并干燥稱重，計算蘆丁產(chǎn)率。

1.2.3 蘆丁的鑒定：取蘆丁樣品及標準品各3～4 mg，加乙醇5～6 mL，使其溶解，進行Mg-HCl及鋯鹽/枸櫞酸的顏色檢測；蘆丁的樣品及其標準品甲醇溶液，濾膜過濾后進行HPLC分析。色譜條件如下：色譜柱為Intersil ODS-3(4.6×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶0.3 %磷酸(35∶65)，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35℃，進樣量10 μL[3]。

2 結(jié) 果

2.1 藥材粉碎粒度及超聲時間對蘆丁產(chǎn)率的影響

粉碎至不同粒度的槐花米粉末，超聲所得蘆丁產(chǎn)率在一定時間范圍內(nèi)均與超聲時間正相關(guān)，而后呈平臺趨勢(圖1)，但隨著超聲時間延長，過濾困難，操作時間明顯延長(圖1)。粉碎粒度不同，提取產(chǎn)率也不同，顆粒越小，提取效果越好(圖2)。5號篩粉末提取效率最高，但過濾困難，操作總時間延長，故但當粒度<3號篩后，提取率沒有明顯提高。綜上因素，在本實驗條件下，采用過3號篩的粉末超聲5 min即達到較高的提取產(chǎn)率(16.46%)，從而大大地縮短了反應(yīng)時間。

圖1 槐花米粉碎粒度及超聲時間對蘆丁產(chǎn)率的影響

*代表粉碎至不同粒度的槐米粉末達到較高提取產(chǎn)率所需時間(粗研粉末：30 min; 1號篩粉末：20 min; 3號篩粉末：5 min； 5號篩粉末：5 min)

圖2超聲時間為5 min時間點不同粉碎粒度槐米的蘆丁產(chǎn)率

*3號篩產(chǎn)率為 (16.46±2.0)%；5號篩粉末產(chǎn)率為 (16.79±2.1)%

2.2 樣品的鑒定

樣品甲醇溶液加入鹽酸-鎂粉后溶液呈紅色；樣品甲醇溶液加入鋯鹽后顯黃色，再加入枸櫞酸后黃色褪去。上述反應(yīng)與蘆丁標準品一致。

提純的蘆丁樣品經(jīng)HPLC分析，在tR= 9.132 min處出現(xiàn)單一色譜峰(圖3A)，紫外圖譜顯示該峰在256 nm 與357 nm 附近有最大吸收(圖3 B)，該圖譜與蘆丁標準品的保留時間及紫外吸收基本一致(圖3C、3D)，故所提樣品為蘆丁。

圖3 蘆丁樣品及標準品的HPLC、UV光譜A 蘆丁樣品的HPLC (tR=9.117 min)；B 蘆丁樣品UV光譜 (λmax=256 nm; 357 nm)C 蘆丁標準品的HPLC (tR=9.132 min)； D 蘆丁標準品UV光譜 (λmax=257 nm; 358 nm)

3 討 論

超聲波提取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用日趨廣泛，其通過液體介質(zhì)引起的空化作用可造成植物細胞壁的瞬間破裂，便于提取溶劑滲透到植物細胞中，從而加速藥材中有效成分的溶出，并且超聲波提取不會改變有效成分的結(jié)構(gòu)，同時減少溶媒用量、提高了提取效率，因而成為一種植物有效成分提取的新方法[5]。

在以往的實驗操作如煎煮法、浸漬法中，藥物一般不宜細粉，但超聲法中因超聲波是一種彈性機械振動波，通過介質(zhì)作用局部可產(chǎn)生巨大壓力和千度高溫，從而適于微粉化原料藥的提取，促進植物細胞破壁，使細胞內(nèi)的有效成分充分暴露出來，迅速、完全地釋放到適宜溶劑中，因而提高提取效率。

本實驗將槐花米粉碎至不同粒度，較短時間超聲下，蘆丁產(chǎn)率隨粒度減小而升高，但粉末<3號篩后，過濾明顯困難，操作時間延長，可能由于粉末過細阻塞濾紙所致。同時，相同粒度粉末超聲所得蘆丁產(chǎn)率在一定時間范圍內(nèi)與超聲時間正相關(guān)，到達一定時間點后，蘆丁粗品產(chǎn)率雖有提高，但精制蘆丁產(chǎn)率卻略有下降，并且過濾困難，其原因可能是隨著超聲時間延長，雜質(zhì)含量增加，而蘆丁在高頻率偏堿性的條件下也可能發(fā)生一定程度地降解。與一般文獻報道采用乙醇為提取溶劑的超聲法[6]比較，本研究采用堿液對微粉的槐花米進行超聲提取能夠明顯縮短反應(yīng)時間，并顯著提高提取效率。雖然，超聲法提取的產(chǎn)率較以前傳統(tǒng)酸堿法的產(chǎn)率稍低[3]，但能夠大大地縮短反應(yīng)時間，從而明顯地提高了蘆丁提取效率。因此，藥材微粉化與超聲法結(jié)合將為天然藥物中有效成分的提取提供一種新的思路。

[1] 臧志和，曹麗萍，鐘鈴. 蘆丁藥理作用及制劑的研究進展[J]. 醫(yī)藥導報，2007,126(17):758-760.

[2] Chen KC, Hsieh CL, Huang KD, et al. Anticancer activity of rhamnoallosan against DU-145 cells is kinetically complementary to coexisting Polyphenolics in Psidium guajava budding leaves [J]. J Agric Food Chem，2009,57(14):6114-6122.

[3] 舒曉宏，馮梅，陳華，等．槐花米中蘆丁提取最佳pH值的實驗研究[J]．大連醫(yī)科大學學報，2005,27(2):91-92．

[4] 馬國剛，王建中，盧曉蕊. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐米蘆丁超聲波提取工藝的研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2007,33(8):167-172.

[5] 吳立軍. 天然藥物化學[M]. 第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.19.

[6] 郭玉，唐國濤，陳淑嫻，等.槐花米中蘆丁提取方法的比較研究[J]．中成藥，2007，29(11):1675-1677.