王洪江，孫尚韶，宋 墨，姜 偉，李克軍，王忠裕

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 普外科， 遼寧 大連 116011)

近年來研究發(fā)現(xiàn)[1,2]乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)特別是樹突狀細(xì)胞的關(guān)系十分密切。樹突細(xì)胞表面的MHCⅠ、Ⅱ類分子、共刺激分子及免疫黏附分子低表達(dá)或不表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞分泌的IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子可能是樹突細(xì)胞抗原提呈功能障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，加重腫瘤細(xì)胞浸潤及出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的原因之一。本實(shí)驗(yàn)通過乳腺癌及其周圍組織中浸潤樹突狀細(xì)胞(tumor infiltration dentric cell，TIDC)及其表面分子表達(dá)的檢測，對(duì)乳腺癌患者局部免疫情況進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本采集：收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科2008年11月～2008年12月收治的乳腺癌病人26例，均為女性，年齡32～76歲，中位年齡51.1歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療，均行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為浸潤性導(dǎo)管癌。標(biāo)本采集均在手術(shù)標(biāo)本離體30 min內(nèi)進(jìn)行，每例患者均取腫瘤及癌旁正常腺體組織，標(biāo)本迅速置于-80℃冰箱中凍存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)中的免疫組化試劑，如鼠抗人CD1a單克隆抗體、鼠抗人CD83單克隆抗體、鼠抗人CD54單克隆抗體、兔抗人S-100蛋白單克隆抗體、SP試劑盒和DAS染色試劑盒、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，均購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司；陽性對(duì)照由北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的切片；陰性對(duì)照使用PBS代替一抗，購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司。TRIZOL Reagent、cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、β-actin、IL-10、TGF-β1、VEGF A引物、100 bpDNA ladder marker均購于或由日本TaKaRa公司大連分公司合成。PCR擴(kuò)增儀：美國MJResearch公司；壓電泳儀：EC Appotatus corporation；凝膠成像系統(tǒng)：Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本處理：手術(shù)切取乳腺癌和癌周新鮮標(biāo)本,取其一部分經(jīng)10%甲醛固定,制成石蠟切片,行免疫組化染色;另一部分用于分離乳腺癌組織和癌周組織單細(xì)胞懸液，用于提取總RNA,采用RT-PCR方法從mRNA水平檢測乳腺癌細(xì)胞中IL-10、TGF-β1及VEGF-A基因的表達(dá)。

1.2.2 免疫組化染色及結(jié)果判定：乳腺癌及癌周標(biāo)本組織切片厚度為4 μm,常規(guī)脫蠟、水化后,3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù),按即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒說明書操作。一抗采用鼠抗人S-100單克隆抗體,設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照,以試劑盒中提供的陽性切片做陽性對(duì)照,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用DAB染色,HE復(fù)染。S-100陽性樹突細(xì)胞以細(xì)漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號(hào)；CD1a陽性樹突細(xì)胞主要以細(xì)胞間質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色信號(hào)；CD83陽性樹突細(xì)胞以細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號(hào)；CD54陽性樹突細(xì)胞主要以胞膜、胞漿出現(xiàn)明顯染色的細(xì)胞。腫瘤組織中的浸潤程度根據(jù)Furukawa等提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：在低倍鏡(×100，Olympus雙目顯微鏡) 下選取癌細(xì)胞密集區(qū)，更換高倍鏡(×400) ，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞的總數(shù)，0～20個(gè)陽性細(xì)胞為陰性；>20個(gè)細(xì)胞為陽性表達(dá)。

1.2.3 乳腺癌組織中IL-10、TGF-β1、VEGF基因的檢測：從-80℃冰箱取出組織標(biāo)本，切取一小塊，約50 mg，提取RNA后，鑒定RNA純度，用RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA，以下列引物作為PCR的模版分別檢測乳腺癌及癌周組織中的IL-10、TGF-β1、VEGF mRNA，在凝膠成像系統(tǒng)紫外線燈下中，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶并記錄圖像。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5和Oligo 6引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，所有引物均由日本TaKaRa公司大連分公司合成，β-actin上游引物： 5’-GGGACCTGACTGACTACCTC-3’、β-actin下游引物：5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’；IL-10上游引物：5’-TCAGGGTGGCGACTCTAT-3’、IL-10下游引物：5’-TGGGCTTCTTTCTAAATCGTTC-3’；TGF-β1上游引物：5’-CGGAGTTGTGCGGCAGTGGTTGAG-3’、TGF-β1下游引物：5’-GGCGCCCGGGTTATGCTGGTTGTA-3’；VEGF上游引物：5’-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3’、VEGF下游引物：5’-CGAACCCTGAGGGAGGCT-3’。RT-PCR結(jié)果判斷：β-actin產(chǎn)物長度為546 bp、IL-10產(chǎn)物長度為199 bp、TGF-β1產(chǎn)物長度為448 bp，VEGF產(chǎn)物長度為420 bp，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶出現(xiàn)在目的條帶區(qū)，即判定為表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌及癌周組織中樹突狀細(xì)胞的表達(dá)情況

S-100+TIDC可見細(xì)漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號(hào)(圖1a)，乳腺癌組織中S-100+TIDC的浸潤數(shù)量明顯比對(duì)照癌旁組織數(shù)量減少；26例乳腺癌組織中S-100+TIDC的表達(dá)為4例，陽性率15.4%;癌旁組織中S-100+TIDC表達(dá)分別22例,陽性率84.6%，明顯高于乳腺癌組織(P<0.05)。

2.2 乳腺癌及癌周組織中樹突狀細(xì)胞的CD1a、 CD83及CD54的表達(dá)

觀察乳腺癌組織中樹突狀細(xì)胞表面分子的免疫組化染色可見細(xì)胞間質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色的CD1a+TIDC(圖1b)、細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色CD83+TIDC(圖1c)和胞膜，胞漿出現(xiàn)明顯染色的CD54+TIDC(圖1d)。26例乳腺癌組織和癌旁組織的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的表達(dá)情況見表1。 癌旁組織的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的陽性表達(dá)明顯高于乳腺癌組織，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 乳腺癌組織中樹突狀細(xì)胞S-100、CD1a、 CD83及CD54的表達(dá)(×400)

CD1a陽性例數(shù)%CD83陽性例數(shù)%CD54陽性例數(shù)%乳腺癌組織519.2519.200癌旁組織2284.62180.81869.2

2.3 乳腺癌及癌周組織中免疫抑制因子IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA、VEGF A mRNA表達(dá)的檢測

26例乳腺癌組織和癌旁組織中均有β-actin的表達(dá)，陽性率為100%；IL-10 mRNA、 TGF-β1mRNA和VEGF A mRNA的表達(dá)見圖2、表2。乳腺癌組織中的IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA表達(dá)陽性率均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 免疫抑制因子的檢測由左至右條帶區(qū)單數(shù)為乳腺癌、雙數(shù)為癌旁組織、最右側(cè)為Maker帶

IL-10mRNA陽性例數(shù)%TGF-β1mRNA陽性例數(shù)%VEGFAmRNA陽性例數(shù)%乳腺癌組織2076.92076.91765.4癌旁組織726.9726.9311.5

3 討 論

樹突狀細(xì)胞是目前的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞[3]，具有捕獲、提呈抗原和致敏初始型T細(xì)胞的功能。成熟DC高表達(dá)MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子和共刺激分子及黏附分子，具有較強(qiáng)的抗原提呈和激活初始型T細(xì)胞能力。其抗腫瘤機(jī)制是樹突狀細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的攝取，即攝取抗原后樹突狀細(xì)胞發(fā)育成熟，膜表面的MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子和共刺激分子和黏附分子形成復(fù)合物，向T細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的激活。同時(shí)也可分泌大量的IL-12，誘導(dǎo)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、淋巴因子激活殺傷細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-γ、穿孔素和顆粒酶，增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞的溶解作用。因此，腫瘤組織中DC發(fā)揮抗原提呈功能受DC數(shù)量、表面分子的表達(dá)和免疫抑制因子等多種因素的影響。

文獻(xiàn)報(bào)告多數(shù)腫瘤組織中浸潤樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和功能，與腫瘤生物行為和預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。Kichles-lakomy等[7]發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者體內(nèi)樹突狀細(xì)胞表達(dá)CDla、CD83、CD80、CD86、CD54明顯低于健康對(duì)照組，激活T淋巴細(xì)胞能力比健康對(duì)照組明顯減弱。李艷萍等[8，9]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織腫瘤浸潤性DC主要集中于癌周和癌旁，癌灶內(nèi)的樹突狀細(xì)胞則分布較少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面可見長、短不等，粗細(xì)不一和數(shù)目不等的突起，其突起與癌細(xì)胞密切接觸，啟動(dòng)抗腫瘤免疫。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色對(duì)26例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析也有相似的結(jié)果：乳腺癌組織中樹突狀細(xì)胞的浸潤數(shù)量比癌旁組織數(shù)量明顯減少，乳腺癌組織中S-100+TIDC陽性率僅為15.4%;癌旁組織則高達(dá)84.6%，說明腫瘤組織中存在腫瘤浸潤性DC的數(shù)量減少，因此導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，可能成為促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的原因之一。

TIDC可表達(dá)多種表面分子，主要包括CD1、CD4、CD33、CD44、CD80及主要組織相容性復(fù)合物-I、II類分子等。這些表面分子使DC能夠迅速地對(duì)微環(huán)境中的改變做出反應(yīng)，攝取各種各樣的免疫原性分子。此外，還需要其表面表達(dá)的共刺激分子、黏附分子的參與，才能完成抗原提呈能力。作者通過免疫組化方法對(duì)乳腺癌TIDC的表面分子及共刺激分子、黏附分子的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，26例患者中有5例腫瘤組織中有CD1a+、CD83+TIDC的表達(dá)、且均不表達(dá)CD54+TIDC，提示TIDC是一種功能低下或無功能的DC，無法有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，可能是TIDC無法有效誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)的原因之一。

造成TIDC功能低下或無功能的原因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞釋放的免疫抑制因子作用于DC所致，導(dǎo)致其表面分子的表達(dá)和功能發(fā)生變化?；A(chǔ)研究表明，抑制浸潤樹突狀細(xì)胞的成熟和遷移的因子主要有IL-10、TGF-β1、VEGF、IL-12等，是可能造成浸潤樹突狀細(xì)胞表型異常及功能低下的原因之一。IL-10、VEGF及TGF-β1均為免疫抑制因子，能夠抑制抗原提呈細(xì)胞的免疫功能。Allavena等[10]研究表明IL-10能降低DC的表面分子如MHC-II、CD80及CD86等的表達(dá)率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力。而IL-10的分泌又受TGF-β的影響，TGF-β的存在可明顯促進(jìn)IL-10的分泌。應(yīng)用抗體阻斷法證實(shí)TGF-β對(duì)抗原提呈細(xì)胞功能的影響是通過IL-10實(shí)現(xiàn)的，而且TGF-β1可下調(diào)MHC-II類分子的表達(dá)。VEGF是一種重要的血管生成刺激因子，由腫瘤細(xì)胞釋放，抑制樹突狀細(xì)胞成熟，導(dǎo)致腫瘤逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可在DC成熟過程的早期影響造血前體細(xì)胞分化為功能成熟的DC[11]。Mitsuhiko Iwamoto等[12]的研究認(rèn)為，VEGF可以抑制CD34+前體細(xì)胞分化為功能成熟的DC,腫瘤浸潤性DC的數(shù)量與VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān),VEGF在抑制腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤性DC的成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Iwanoto等[12，13]研究了130例乳腺癌患者浸潤樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD83+浸潤樹突狀細(xì)胞與長期不復(fù)發(fā)和生存率有顯著關(guān)系。并分析得出CD83+浸潤樹突狀細(xì)胞浸潤與VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)論在腫瘤內(nèi)有CD83+浸潤樹突狀細(xì)胞是調(diào)控腫瘤免疫的重要因素。Takahashi等研究了人類胃癌組織中浸潤樹突狀細(xì)胞與VEGF-C的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞在腫瘤中數(shù)量與VEGF-C的浸潤呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示乳腺癌組織均有IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA高水平的表達(dá)，而癌旁組織中表達(dá)水平很低或無表達(dá)，說明乳腺癌組織局部有多量的免疫抑制因子存在，這些免疫抑制因子單獨(dú)或聯(lián)合作用可能造成樹突狀細(xì)胞表面的MHCⅠⅡ類分子、共刺激分子、免疫黏附分子低表達(dá)或不表達(dá)的原因之一，從而降低樹突狀細(xì)胞抗原提呈功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[12]。

因此，乳腺癌組織中浸潤性樹突狀細(xì)胞數(shù)量減少， IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子高表達(dá)以及乳腺癌中樹突狀細(xì)胞的MHC-Ⅱ類分子、黏附分子和共刺激分子等表面分子低表達(dá)或不表達(dá)，致使浸潤性樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能受抑制，使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。進(jìn)一步研究腫瘤微環(huán)境中TIDC表型及功能狀態(tài)變化的原因，有助于深入認(rèn)識(shí)腫瘤免疫逃逸機(jī)制。

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數(shù)字的表達(dá)方式

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