魏 玲， 李蘇宜， 曹蘇生

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，對其預后文獻報道不一，總的5年生存率為20%左右[1]。Bmi-1是多梳基因(PcG)家族成員，首次被提出是在1991年，Haupt等[2]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因鼠的淋巴瘤細胞傳代中，其作為一種原癌基因與另一種癌基因C-myc協(xié)同作用可引起細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。bmi-1基因與腫瘤形成、預后的關(guān)系在國內(nèi)外正在逐步受到重視。但是，關(guān)于Bmi-1在食管癌組織中的表達研究，目前僅有國外的少量報道。本研究旨在通過免疫組化染色的方法，檢測Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達，以探討其與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集徐州市中心醫(yī)院2002年至2008年保存的食管癌石蠟標本30例，所有病例均經(jīng)病理學確診為食管鱗癌。其中男性24例，女性6例，中位年齡59歲。根據(jù)TNM分期法,臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期的病例18例,Ⅲ期的病例12例；30例中有16例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,14例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有組織標本均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋。

1.2 試劑與方法 每個蠟塊取4 μm厚連續(xù)切片做免疫組化染色。鼠抗人Bmi-1單克隆抗體購自英國Abcam公司,抗體稀釋液和二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉公司。

用免疫組化方法檢測食管鱗癌組織中Bmi-1的表達。先將切片置于二甲苯中脫蠟,乙醇梯度水化處理, 檸檬酸緩沖液抗原煮沸修復,滴加鼠抗人Bmi-1(1∶50, 英國Abcam公司)，37℃孵育 1 h，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體,DAB顯色,蘇木精復染,鹽酸乙醇固定,封片,觀察。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 光學顯微鏡下觀察組織標本的著色程度。Bmi-1蛋白陽性表達主要表現(xiàn)為細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。高倍鏡下(放大400倍)隨機取4個不同的視野,計數(shù)細胞總數(shù)及核陽性細胞數(shù),按陽性細胞所占的百分比計分:陽性細胞率≤10%為1分,陽性細胞率>10%而≤50%為2分,陽性細胞率>50%而≤75%為3分,陽性細胞率>75%為4分。同時,根據(jù)染色的強弱程度計分:陰性染色1分,弱染色2分,中等強度染色3分,強染色4分。根據(jù)二者的乘積判斷結(jié)果:≤4分為(-)，>4分而≤8分為(+)，>8分而≤12分為(++)，>12分而≤16分為(+++)。統(tǒng)計分析時(-)和(+)合計為陰性表達,(++)和(+++)合計為陽性表達。以上結(jié)果均至少由兩位病理科醫(yī)生以雙盲法觀察確定。

1.4 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)用R×C表Fisher′s Exact Test 進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達 Bmi-1的陽性表達主要為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(見圖1)。30例食管鱗癌標本中Bmi-1的陽性率為26.6%(8/30), 食管癌旁組織標本中Bmi-1的陽性率為6.6%(2/30),可見 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。

圖1 Bmi-1在食管癌組織中的陽性表達

2.2 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 Bmi-1蛋白高表達與食管鱗癌TNM分期、浸潤深度密切相關(guān),即Bmi-1蛋白在侵及肌層的食管鱗癌中的表達明顯低于在腫瘤侵及外膜的食管鱗癌中表達; TNM分期中Ⅲ期的患者Bmi-1蛋白表達高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05),但與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) (P>0.05)。(見表1)

表1 Bmi-1的表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

人類bmi-1基因位于第10號染色體短臂13區(qū)(10p13)， Bmi-1蛋白與果蠅Psc和Su(z)2蛋白結(jié)構(gòu)相似，其氨基端為環(huán)指結(jié)構(gòu)域(ring finger domain，RF)，中間部分為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(H-T-H-T-H-T)結(jié)構(gòu)，是DNA結(jié)合域，正是這兩個區(qū)域與細胞轉(zhuǎn)錄及腫瘤形成有關(guān)[2]。Bmi-1是一種廣泛表達的核蛋白, 參與干細胞的自我更新和維持，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，高表達的Bmi-l被認為是腫瘤中存在的腫瘤干細胞。Dirks[3]報道，Bmi-1低表達的腫瘤細胞有較低的侵襲性，因為他有較少的干細胞。最近一些研究[4]顯示Bmi-1 高表達時負性調(diào)控 p16INK4a 蛋白表達, 使 p16INK4a 蛋白表達下調(diào)，促進細胞周期進入 S 期，從而促使細胞的生長和增殖； Bmi-1 高表達還抑制 p19ARF，阻止細胞周期停滯和細胞凋亡，導致細胞增殖。Bmi-1直接參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移。Bmi-1在血液系統(tǒng)惡性腫瘤及肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤中表達異常。Song等[5]研究證實Bmi-1在胰腺癌細胞株和胰腺癌組織中起正調(diào)節(jié)作用，Bmi-1高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Bmi-1陽性表達者生存率低。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1蛋白過度表達與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Bmi-1陽性者的5年生存率明顯低于 Bmi-1陰性者，在多因素分析中 Bmi-1是影響生存率的因素，其表達上調(diào)是結(jié)腸癌患者預后不良的標志。對146例原發(fā)胃癌患者進行的研究發(fā)現(xiàn)[7], 免疫組化結(jié)果顯示有99例表達了Bmi-1, Bmi-1的過表達程度與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有高度相關(guān)性, 通過RT-PCR證明胃癌組織中Bmi-1的翻譯和轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。作者認為, Bmi-1可成為胃癌的診斷和獨立預后指標之一。日本兵庫醫(yī)學院Fujiwara等[8]的研究表明,對于食管鱗狀細胞癌患者,干細胞標志物Bmi-1表達陽性與新輔助放化療后早期復發(fā)及預后不良相關(guān), Bmi-1陽性提示食管癌預后不佳。

本實驗結(jié)果表明，Bmi-1在食管鱗癌旁組織中的表達低于鱗癌組織，與He等[9]報道的結(jié)果一致。Bmi-1蛋白表達在食管鱗癌旁組織和食管鱗癌組織中呈逐漸上調(diào)趨勢，食管鱗癌組織中存在Bmi-1蛋白高表達現(xiàn)象提示Bmi-1 蛋白與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。有研究表明Bmi-1蛋白的表達水平隨著腫瘤分化水平的降低而升高， 即其表達水平越高， 腫瘤的生物學行為越差[10]。本研究顯示Bmi-1蛋白高表達率與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與TNM病理分期和浸潤深度相關(guān)。即 Bmi-1蛋白在侵及外膜的食管鱗癌的表達明顯高于侵及肌層者；TNM 分期中的Ⅲ期患者 Bmi-1 蛋白表達高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。以上結(jié)果提示食管鱗癌組織中 Bmi-1 蛋白高表達是判斷食管鱗癌患者預后不良的參考指標之一。

本研究結(jié)果顯示Bmi-1 蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，這有兩種可能性，(1)Bmi-1的表達確實與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，(2)樣本例數(shù)不夠多。因此，有必要擴大樣本量的研究，以進一步證實這一論斷。另外，本研究還提示Bmi-1過表達在食管鱗癌的發(fā)生中可能具有重要意義，Bmi-1基因檢測的進一步深入研究應(yīng)針對其作為預后分子靶標、治療相關(guān)敏感性預測的價值做出判斷，進而為治療提供新靶點。

[1] Tew WP, Kelsen DP, Ilson DH. Targeted therapies for esophageal cancer[J]. Oncologist, 2005,10 (8):590-601.

[2] Haupt Y, Alexander WS, Barri G, et al.Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in E mu-myc transgenic mice[J].Cell，1991，65(5)：753-763.

[3] Dirks P. Bmi1 and cell of origin determinants of brain tumor phenotype[J]. Cancer Cell, 2007，12(4):295-297.

[4] Park IK, Morrison SJ, Clarke MF. Bmi1, stem cells, and senescence regulation[J]. J Clin Invest,2004,113(2):175-179.

[5] Song W, Tao K, Li H, et a1.Bmi-1 is related to proliferation, survival and poor prognosis in pancreatic cancer[J].Cancer Sci，2010，101(7)：1754-1760.

[6] Li DW, Tang HM, Fan JW, et a1.Expression level of Bmi-1 oncoprotein is associated with progression and prognosis in colon cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(7)：997-1006.

[7] Liu JH,Song LB,Zhang X,et al.Bmi-1 expression predicts prognosis for patients with gastric carcinoma[J].J Surg Oncol,2008,97(3):267-272.

[8] 張小邊.AGA、ASCO、ASTRO、SSO 2009年胃腸道癌癥研討會報道[N].中國醫(yī)學論壇報，2009-02-12(35).

[9] He XT, Cao XF, Ji L, et al. Association between Bmi1 and clinicopathological status of esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol, 2009,15(19): 2389-2394.

[10] Reinisch CM, Uthman A, Erovic BM, et al.Expression of BMI-1 in normal skin and inflammatory and neoplastic skin lesions[J].J Cutan Pathol，2007，34(2)：174-180.