肖曉光,李艷蓮,王 晶,曲淑賢

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連 116011；2.遼寧省醫(yī)學(xué)細胞分子生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116044)

乙型肝炎在我國廣泛流行，人群感染率極高。目前雖然出現(xiàn)了許多治療乙型肝炎的藥物，但是對于藥物療效的觀察還多依賴于轉(zhuǎn)氨酶的測定、eAg 的變化及HBV DNA的定量測定，這些項目在乙肝早期治療效果的監(jiān)測上還不夠敏感。乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)是乙肝病毒的mRNA和前基因組RNA的復(fù)制模板，它的存在是病毒復(fù)制存在的標志，也是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[1]。本文通過對乙肝患者外周血外周血單個核細胞中HBV cccDNA檢測，探討外周血單個核細胞中HBV cccDNA的定量測定對乙型肝炎患者治療效果監(jiān)測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2009年1月～2009年11月，在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診和住院患者隨機抽取進行肝功檢測乙肝HBsAg(+)，且未經(jīng)過藥物治療的乙型肝炎患者,共100例，采集血清標本進行HBV DNA檢測，采集EDTA 抗凝血進行單個核細胞HBV cccDNA檢測。同時隨機留取在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診和住院患者已確診為慢性乙肝患者40例,乙肝HBsAg(+)肝硬化患者30例，采集EDTA 抗凝血進行單個核細胞中HBV cccDNA檢測。此外，還留取在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染病房住院治療的急性乙肝患者1例，分別在其發(fā)病初期，治療1周，2周，1個月和3個月時，采集患者血清標本進行HBV DNA檢測，采集EDTA 抗凝血進行單個核細胞HBV cccDNA檢測。對乙型肝炎的診斷均符合2000年中華傳染病與寄生蟲病分會、肝病學(xué)分會修訂的病毒性肝炎防治方案的診斷標準,慢性乙型肝炎的診斷符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》標準,肝硬化診斷標準符合中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒肝炎防治方案。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：Lightcycler熒光PCR儀為ROCHE公司生產(chǎn)。

1.2.2 試劑：血清HBV DNA檢測試劑盒購自深圳匹基生物有限公司。

外周血淋巴細胞HBV cccDNA檢測試劑由北京索奧生物藥業(yè)科技有限公司提供。

外周血淋巴細胞HBV cccDNA提取試劑盒由北京帕弗瑞公司提供。

1.3 HBV DNA和HBV cccDNA檢測

1.3.1 外周血單個核細胞HBV cccDNA提?。涸谖⒘侩x心管中加入20 μL蛋白酶 K，200 μL全血樣本和200 μL溶血劑，震蕩15 s，56 ℃ 放置10 min，加入無水乙醇200 μL，震蕩15 s，將全部液體移入提取柱中，按照操作逐步洗脫。最后獲得HBV cccDNA模板。

1.3.2 HBV cccDNA標準品的配置：將陽性質(zhì)控品用雙蒸水進行10倍，100倍，1000倍的稀釋，得到1×106copies/mL，1×105copies/mL，1×104copies/mL的標準品。

1.3.3 試劑準備：HBV cccDNA試劑準備：按樣本數(shù)(血清樣本+陰性對照+陽性對照+標準品)N取HBV cccDNA PCR反應(yīng)液n×24 μL、Tap酶n×2 μL，混合均勻后低速離心5 s，按每管26 μL加入毛細管中。分裝后反應(yīng)管可在2～8 ℃放置3 h。

HBV DNA試劑準備：按樣本數(shù)(血清樣本+陰性對照+陽性對照+標準品)N取HBV PCR反應(yīng)液n×17.8 μL、Tap酶n×0.2 μL，UNG n×0.03 μL混合均勻后低速離心5 s，按每管18 μL加入毛細管中。分裝后反應(yīng)管可在2～8 ℃放置3 h。

1.3.4 標本加樣：HBV cccDNA標本加樣：將HBV cccDNA模板、陰性對照、陽性對照和標準品，各4 μL加入于反應(yīng)毛細管中，低速離心5 s，取出置全自動定量PCR儀上進行反應(yīng)。

HBV DNA標本加樣：將HBV DNA模板、陰性對照、陽性對照和標準品，各2 μL加入于反應(yīng)毛細管中，低速離心5 s，取出置全自動定量PCR儀上進行反應(yīng)。

1.3.5 PCR擴增：HBV cccDNA PCR擴增：取PCR反應(yīng)管，按順序放入Lightcycler-PCR擴增儀中，按下面的程序進行設(shè)定反應(yīng)條件： 93℃，2 min→(93℃，30 s→ 55℃，45 s)循環(huán)40次。

HBV cccDNA PCR擴增：取PCR反應(yīng)管，按順序放入Lightcycler-PCR擴增儀中，按下面的程序進行設(shè)定反應(yīng)條件： 37℃，3 min→92℃，1 min→(92℃，5 s→60℃，30 s)循環(huán)40次。

1.3.6 結(jié)果分析：取高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值。

1.3.7 質(zhì)量控制：試劑質(zhì)量完好并操作正確，陽性對照應(yīng)檢測為相應(yīng)的范圍，陰性對照應(yīng)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。

1.3.8 結(jié)果檢測：采用 LightCycler Data Analysis分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

通過χ2檢驗對各組間差異性進行分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 隨機乙型肝炎患者HBV DNA和 HBV cccDNA檢測結(jié)果

100例隨機選取的乙型肝炎患者中， HBV DNA和 HBV cccDNA含量比較，見表1。

在57例HBV DNA陰性(含量<5×102copies/mL)的乙型肝炎患者中，HBV cccDNA含量均為陰性(含量<5×102copies/mL)。

2.2 HBV DNA含量>5×102乙肝患者人群中HBV cccDNA含量對比

表1 HBV DNA和 HBV cccDNA含量比較

43例HBV DNA含量>5×102乙肝患者人群中,血清HBV DNA和外周血單個核細胞中HBV cccDNA含量對比情況，結(jié)果見表2。

2.3 隨機乙肝人群,慢性乙肝和肝硬化患者HBV cccDNA 的含量比較

100例隨機乙肝人群,40例慢性乙肝患者和30例肝硬化患者,外周血單個核細胞 HBV cccDNA 的含量比較,結(jié)果見表3。

表2 HBV DNA含量>5×102乙肝患者人群中血清HBV DNA和外周血單個核細胞中HBV cccDNA含量對比Tab 2 Compare the concentration of HBV cccDNA in peripheral blood mononuclear cells and HBV DNA in serum within concentration of HBV DNA>5×102 copies/mL

1)與HBV DNA含量>1×105copies/mL乙肝患者人群比例比較，P>0.05；2)與1×102

表3 隨機乙肝人群、慢性乙肝患者和肝硬化患者外周血 HBV cccDNA含量比較Tab 3 Compare the concentration of HBV cccDNA of the random hepatitis B patients,chronic hepatitis B patients and HBsAg(+),liver cirrhosis patients

1)與隨機乙肝人群組比較，P<0.05；2)與慢性乙肝患者組之間比較，P<0.05

2.4 治療過程中HBV DNA 和HBV cccDNA變化情況

1例急性乙肝患者，治療過程中HBV DNA 和HBV cccDNA變化情況，見表4。

表4急性乙肝患者治療過程中HBV DNA和HBV cccDNA變化情況

Tab 4 Compare the concentration change of HBV DNA and HBV cccDNA in acute hepatitis B patient during the therapy

HBVDNA含量(copies/mL)HBVcccDNA含量(copies/mL)治療前>5×1076．8×106第1周1．2×1074．7×104第2周3．3×1051．1×1031個月1．6×103<5×1023個月<5×102<5×102

3 討 論

HBV cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始合成模板，是乙肝病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素，也是乙肝病毒復(fù)制的“發(fā)動機”，當乙肝病毒進入肝細胞后，釋放出的基因組為松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，然后將其轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行復(fù)制，此時rcDNA 缺口閉合，轉(zhuǎn)變成cccDNA，開始復(fù)制周期。因此，HBV cccDNA是乙肝病毒復(fù)制的最早中間體。雖然其含量較少，每個肝細胞內(nèi)只有約5～50個拷貝，但對于乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義。

本文中作者采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法對乙型肝炎患者血清中HBV DNA含量和外周血中單個核細胞中HBV cccDNA含量情況進行研究。結(jié)果表明：在HBV DNA 陰性(含量<5×102copies/mL)的乙型肝炎患者人群中HBV cccDNA全部陰性(含量<5×102copies/mL)；在HBV DNA較高含量(>1×105copies/mL)的17例乙肝患者中,HBV cccDNA>5×102例數(shù)為13例(76.4%)，兩者差異無顯著性意義；而在HBV DNA低含量(<1×105copies/mL)的26例乙肝患者中,HBV cccDNA>5×102為9例(34.6%),陽性率明顯降低，(P<0.05)。說明進行外周血單個核細胞中HBV cccDNA檢測可以作為乙肝病毒高復(fù)制的一個檢測指標[2]。

通過實驗作者還檢測到在100例隨機乙型肝炎患者中,HBV cccDNA>5×102例數(shù)為22例，占22%；40例慢性乙肝患者中HBV cccDNA>5×102例數(shù)為17例，占42.5%；30例肝硬化患者中，HBV cccDNA>5×102例數(shù)為20例，占66.7%；各組患者之間比例明顯增加(P<0.05)。這與馬艷麗等[3]的研究結(jié)果是一致的。說明乙肝患者病情輕重和乙肝病毒復(fù)制的強弱有一定關(guān)系，從理論上推測，當肝臟組織處于炎癥活動階段時，存在于肝細胞胞質(zhì)和線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內(nèi)的HBV cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應(yīng)該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重、變性壞死的細胞越多[4]。因此，隨著病情的發(fā)展，從慢性乙肝到肝硬化患者人群中HBV cccDNA的陽性率在逐漸增加[5]。

此外，在對1例急性乙型肝炎患者的治療追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當使用抗乙肝藥物治療后，從第1周起，患者體內(nèi)的HBV cccDNA 含量就開始呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，比HBV DNA 的下降要早的多。說明HBV cccDNA的動態(tài)檢測對抗乙肝藥物療效的觀察是比HBV DNA檢測更敏感的指標。目前，臨床上評價干擾素、核苷類似物這些抗乙肝病毒藥物的療效，主要依靠檢測乙肝病毒e抗原和乙肝病毒DNA水平高低、肝功能變化情況以及肝組織的病理學(xué)改變等[6]，這些指標對臨床醫(yī)師判斷患者病情而言非常重要和實用，也是臨床醫(yī)師選用抗乙肝病毒藥物的依據(jù)[7]。但是，對于藥物早期療效的監(jiān)測，光靠血清中HBsAg或HBVDNA是遠遠不夠的，需要結(jié)合HBV cccDNA的動態(tài)定量測定才能更準確地反應(yīng)出患者體內(nèi)的真實情況[8]。應(yīng)該把治療前后外周血中HBV cccDNA含量的變化納入到抗乙肝病毒藥物評價的指標體系中來。由于外周血中HBV cccDNA含量較低，用普通的PCR 方法檢測比較困難，而肝內(nèi)HBV cccDNA的檢測標本來源比較困難，所以對HBV cccDNA的檢測一直開展不起來。本研究采用RT-PCR 的方法檢測外周血單個核細胞中HBV cccDNA 的含量，具有高靈敏性和高特異性，適用于大量臨床標本的快速檢測，使臨床對HBV cccDNA進行常規(guī)檢測成為可能。

應(yīng)用RT-PCR 的方法對外周血單個核細胞中HBV cccDNA的檢測，對于乙型肝炎患者的抗病毒治療效果的監(jiān)測和預(yù)后的判斷都具有深遠的臨床意義。

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