張盛林，陳海龍，殷 朔

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 大連 116011)

急腹癥并發(fā)膿毒癥或膿毒性休克已經(jīng)成為急腹癥病人病情加重甚至死亡的主要原因。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)活化釋放的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha ，TNF-α )是導(dǎo)致膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的重要炎癥因子[1]。為此，本研究通過檢測急腹癥并發(fā)膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TNF-α的基因表達(dá)，研究其與血清TNF-α和血漿內(nèi)毒素(endotoxin，ET)水平的相關(guān)關(guān)系。并觀察中藥復(fù)方清下湯的治療效果，探討急腹癥并發(fā)膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞的活化及復(fù)方清下湯治療作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及分組

2002年8月～2003年2月收入大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科及急診ICU的38例外科急腹癥并發(fā)膿毒癥患者。膿毒癥的診斷符合1991年美國胸科醫(yī)師學(xué)會(ACCP)和危重病醫(yī)學(xué)會(SCCM)聯(lián)席會議制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。凡重度營養(yǎng)不良、免疫系統(tǒng)疾病、使用免疫抑制劑及接受放射或化學(xué)治療的惡性腫瘤患者均予排除。其中男性21例，女性17例；年齡(59.8±17.3)歲。患者被隨機(jī)分成常規(guī)治療組(簡稱常規(guī)組)和常規(guī)+中藥治療組(簡稱中藥組)。(1)常規(guī)組：22例，采用西醫(yī)綜合治療。 (2)中藥組：16例，西醫(yī)綜合治療的基礎(chǔ)上給予復(fù)方清下湯。(3)對照組：健康志愿者10例。全部患者中30例存活，8例死亡。若無臨床死亡、提前離院則觀察7 d。所有患者在確定為研究對象時，進(jìn)行APACHEⅡ評分。兩組病人年齡、性別、疾病構(gòu)成、膿毒性休克例數(shù)及APACHEⅡ評分之間差異無顯著性意義。見表1。

表1 兩組病人一般情況的比較Tab 1 Comparison of patient characteristics in two groups (n)

1.2 中藥復(fù)方清下湯成份及給藥方法

大黃15 g、川樸15 g、枳實12 g、芒硝15 g、連翹20 g、公英20 g、雙花30 g、梔子20 g、牡丹皮20 g；其中大黃后下，芒硝沖服。水煎法制成湯劑，每日一劑，每劑200 mL，早晚分服，不能口服者經(jīng)胃管注入后閉管2 h或由肛管給藥保留灌腸，直至消化功能恢復(fù)。

1.3 血漿ET與血清TNF-α測定

分別于入院后24 h內(nèi)，第3、7天清晨無菌操作采集外周靜脈血，分離血漿及血清。鱟試劑偶氮基質(zhì)顯色法定量檢測血漿ET含量，放免法檢測血清TNF-α水平。

1.4 外周血單核細(xì)胞的分離

分別于入院后24 h內(nèi)、第7天取肝素抗凝血3 mL，用pH7.4的含HEPES的RPMI1640培養(yǎng)基等倍稀釋后，置于淋巴細(xì)胞分離液上，兩者體積比為2∶1；室溫下，水平離心(2，000 r/min,25 min)；用毛細(xì)吸管于血漿與分離液界面上吸出界面層細(xì)胞，移入另一離心管中；PBS液離心(1500 r/min,10 min)洗滌3次；用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，25mmol/L Hepes)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ mL的細(xì)胞懸液，接種24孔培養(yǎng)板，于5%CO2、37℃潮濕培養(yǎng)1 h，去除上清液。胎盤蘭染色，鑒別細(xì)胞活力大于95%，GIMSA-Wright氏染色細(xì)胞純度大于90% 。

1.5 RT-PCR法檢測單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)水平

1.5.1 細(xì)胞總RNA的提取及單鏈cDNA的合成：按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體系如下：4 μL Mgcl2，2 μL 10×RNA PCR Buffer，8.5 μL Rnase Free H2O，2 μL DNTP Mixture，0.5 μL Rnase inhibitor，1 μL AMV Reverse Transcriptase，1 μL Random 9mers，1 μL模板RNA ，總反應(yīng)體積20 μL。反應(yīng)條件：30℃ 10 min，50℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。

1.5.2 PCR反應(yīng)：TNF-α 引物[3]：P(T1) (sense) 5’-CAG AGG GAA GAG TTC CCC AG-3’；P(T2) (anti-sense) 5’-GCA GAG GAT GGT CTG GTT CC-3’。擴(kuò)增片斷為325個堿基。內(nèi)參β-actin引物[3]：P(A1) (sense) 5’-TTC CAG CCT TCC TTC CTG G-3’；P(A2) (anti-sense) 5’-aac gag gag gac tcg cgt t-3’。擴(kuò)增片段為225堿基。反應(yīng)體系如下：3 μL Mgcl2，4 μL 10×LA PCR Buffer Ⅱ，30.75 μL滅菌蒸餾水，0.25 μL TakaRa LA Taq，0.5 μL P(T1)，0.5 μL P(T2)，0.5 μL P(A1)，0.5 μL P(A2)，10 μL S(cDNA)，總反應(yīng)體積50 μL。反應(yīng)條件(30個循環(huán))：94℃ 20 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，72℃ 10 min，4℃ 5 min。

1.5.3 定量：取10 μL PCR產(chǎn)物，3%瓊脂糖凝膠電泳。采用計算機(jī)凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析圖像，以灰度表示電泳帶的強(qiáng)弱，與內(nèi)參照的比值作為基因表達(dá)的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血漿內(nèi)毒素(ET)濃度變化

常規(guī)組24 h、第3、7天及中藥組24 h、第3天血漿內(nèi)毒素含量均明顯高于正常對照組(P<0.01)；第7天，常規(guī)組和中藥組其血漿內(nèi)毒素水平與入院24 h相比均明顯降低(P<0.05)，尤以中藥組更為顯著(P<0.01)；第7天，中藥組血漿內(nèi)毒素水平明顯低于常規(guī)治療組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血漿內(nèi)毒素濃度比較Tab 2 Plasma levels of ET in each group

1)與對照組相比，P<0.01；2)與24 h組相比,P<0.05，3)P<0.01；4)與常規(guī)組相比,P<0.05

2.2 血清TNF-α 濃度變化

常規(guī)組24 h、第3、7天血清TNF-α 水平明顯高于對照組(P<0.01)且無下降趨勢；中藥組第3、7天血清TNF-α 水平與入院24 h及常規(guī)組同期相比均有所下降，第7天差異有顯著性意義(P<0.05)。見表3。

2.3 外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)

入院24 h內(nèi)常規(guī)組和中藥組外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)水平，與對照組相比，明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與入院24 h相比，第7天，常規(guī)組和中藥組TNF-α mRNA水平明顯降低(P<0.01)；第7天，中藥組TNF-α mRNA表達(dá)水平低于常規(guī)組(P<0.05)。見圖1、表4。

表3 各組血清TNF-α 濃度比較Tab 3 Serum levels of TNF-α in each group

1)與對照組相比,P<0.01；2)與入院24 h組相比,P<0.05；3)與常規(guī)組相比,P<0.01

圖1 各組TNF-α mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖例

←所示為：TNF-αmRNA 擴(kuò)增片段(325bp)及β-action mRNA(內(nèi)參照)擴(kuò)增片段(225bp)；Lane 1：中藥組24 h；Lane 2：中藥組7 d；Lane 3：對照組；Lane 4：常規(guī)組24 h；Lane 5：常規(guī)組7 d；Ma：DL2,000 DNA Marker；Mb：100bp DNA Ladder Marker.

Fig 1 Electropherogram of TNF-α mRNA RT-PCR product in each group

表4各組單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)比較(TNF-α /actin灰度比值)

Tab 4 TNF-αmRNA expression in monocytes of each group patients (TNF-α /actin)

組別24hnTNF-αmRNA第7天nTNF-αmRNA對照組80．071±0．04580．077±0．053常規(guī)組110．430±0．2012)110．227±0．0581)3)中藥組80．502±0．2332)80．150±0．0653)4)

1)與對照組相比，P<0.05；2)與對照組相比，P<0.01；3)與入院24 h組相比，P<0.01；4)與常規(guī)組相比，P<0.05

2.4 膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA、內(nèi)毒素、TNF-α 三者之間的相關(guān)分析

膿毒癥患者入院24 h、第7天TNF-α mRNA表達(dá)與同期血漿內(nèi)毒素水平及血清TNF-α 含量之間分別呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA、內(nèi)毒素、TNF-α相關(guān)分析

Tab 5 Correlation analysis of ET,TNF-αand TNF-αmRNA expression in peripheral blood monocytes of sepsis patients

24h第7天TNF-αmRNA/TNF-αr0．5750．787P<0．05<0．01TNF-α/ETr0．430．592P<0．01<0．05

3 討 論

目前認(rèn)為，嚴(yán)重感染所誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)及器官功能損害并不是細(xì)菌或毒素直接作用的結(jié)果，而是由于細(xì)菌和毒素刺激機(jī)體釋放過量的細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)，形成瀑布樣鏈鎖放大反應(yīng)，引起嚴(yán)重的組織細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭[4,5]。TNF-α 是一個具有157個氨基酸的蛋白，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞分泌，具有廣泛的生物活性，是機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)[6]。多種致炎因子中,G-菌胞壁成分特別是內(nèi)毒素脂多糖(LPS)是TNF-α 釋放的強(qiáng)有力刺激物。Turpin 等[7]用LPS刺激離體的外周血單核細(xì)胞，結(jié)果顯示：培養(yǎng)單核細(xì)胞的上清液中TNF-α 濃度增高并伴有TNF-α mRNA表達(dá)增強(qiáng)。袁建成等[8]在嚴(yán)重燙傷大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)：燙傷早期，即可見門、腔靜脈血漿內(nèi)毒素和TNF-α 含量明顯升高，并且肝、脾、肺、腎及小腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)也增強(qiáng)，兩者具有明顯相關(guān)性；原位雜交技術(shù)顯示單核巨噬細(xì)胞是TNF-α 的主要分泌細(xì)胞。上述體外及動物實驗證實：單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在有LPS存在的環(huán)境中，受刺激活化，表現(xiàn)出TNF-α mRNA表達(dá)增強(qiáng)及TNF-α分泌增多。本研究實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，急腹癥并發(fā)膿毒癥常規(guī)組患者血清TNF-α濃度顯著增高，外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)也增強(qiáng)。相關(guān)分析表明：膿毒癥患者血清TNF-α水平與血漿內(nèi)毒素水平呈顯著正相關(guān)，外周血單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)水平與內(nèi)毒素水平也呈顯著正相關(guān)。提示：增高的血漿內(nèi)毒素刺激了單核細(xì)胞的活化，引起了TNF-α mRNA表達(dá)增強(qiáng)，合成、釋放TNF-α 入血增多引起了血清TNF-α水平升高。隨著血漿內(nèi)毒素水平的下降，對單核細(xì)胞刺激減弱，單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)下降，合成釋放減少，血清中的TNF-α 水平降低，患者的膿毒性反應(yīng)緩解。增高的TNF-α ：(1)可致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等直接細(xì)胞毒性作用[9]；(2)誘導(dǎo) IL-6、IL-1等基因表達(dá)，導(dǎo)致IL-6、IL-1等前炎癥細(xì)胞因子的釋放；(3)促進(jìn)中性粒細(xì)胞積聚、激活、釋放多種炎癥介質(zhì)包括血小板活化因子、白三烯B4、一氧化氮、血栓素A2、前列腺素和氧自由基，介導(dǎo)組織和器官損傷[10]。因此，減少血漿內(nèi)毒素水平，抑制單核細(xì)胞的活化，對阻斷膿毒癥的發(fā)展具有重要的意義。本課題組以往的臨床研究發(fā)現(xiàn)，急腹癥患者腸道屏障損傷，腸黏膜通透性增強(qiáng)，并且均具有不同程度的腸麻痹，腸內(nèi)容物的運(yùn)行不暢，以致腸道瘀滯，腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素易于移位入血，形成內(nèi)毒素血癥。國外研究表明，絕大多數(shù)臨床病例可能是腸道細(xì)菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素易位進(jìn)入血流而導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生[11]。因此，腸道可能是內(nèi)毒素血癥的“策源地”。 本研究中藥組應(yīng)用復(fù)方清下湯，主用枳(枳實)、樸(厚樸)、硝(芒硝)、黃(大黃)四味，進(jìn)行通里攻下，排除胃腸積滯、瀉下通便，瀉火解毒；同時輔以連翹、公英、雙花、梔子和牡丹皮清熱、解毒、涼血[12]。如此清下兼施，清熱通腑，通腑泄熱，相輔相成。本研究顯示，常規(guī)組其血漿內(nèi)毒素水平下降緩慢，至第7天仍明顯高于正常對照組，而中藥組則下降迅速，至第7天其內(nèi)毒素水平明顯低于同期常規(guī)組，接近正常對照組。其根源可能在于，應(yīng)用中藥復(fù)方清下湯通里攻下，排出腸道積滯后，腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素隨腸內(nèi)容物排出體外，減少內(nèi)毒素吸收入血及細(xì)菌移位，血漿內(nèi)毒素濃度降低，抑制了單核細(xì)胞的活化，導(dǎo)致單核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)及內(nèi)源性酶促反應(yīng)減弱，TNF-α釋放減少，血清中TNF-α含量降低，機(jī)體膿毒癥狀減輕。因此，復(fù)方清下湯治療膿毒癥是通過減少腸源性內(nèi)毒素的吸收及抑制單核細(xì)胞的活化而減少TNF-α的釋放，從而阻斷膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展成為多器宮功能障礙綜合征，提高臨床治療效果。

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