張新宇,王 覓,尹 兵

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,遼寧 大連 116011；2.青島市婦女兒童保健中心 山東 青島 266000；3.大連醫(yī)科大學護理系,遼寧 大連 116044 )

隨著臨床分子生物學的發(fā)展,關(guān)于腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)對滋養(yǎng)細胞影響的研究日益受到關(guān)注。本文采用自建的人早期妊娠滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)體系,研究不同濃度TNF-α對滋養(yǎng)細胞增殖活性及人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)分泌的影響,從而分析TNF-α 的濃度與滋養(yǎng)細胞之間的量效關(guān)系,為研究反復流產(chǎn)的發(fā)病機制、預測再次發(fā)生自然流產(chǎn)的風險以及評價治療效果提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

標本來源：取2008年3月～8月在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行人工流產(chǎn)手術(shù)的絨毛標本,術(shù)前B超證實妊娠囊直徑30 mm左右。將標本置于無菌彎盤中,用高壓滅菌的Hanks液反復沖洗,挑出完整絨毛組織,加入無血清培養(yǎng)液的離心管,置于無菌冰壺保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 滋養(yǎng)細胞的分離與鑒定：制備滋養(yǎng)細胞懸液,光鏡下判定活細胞并計算其濃度,用免疫組織化學方法對分離出的滋養(yǎng)細胞進行純度鑒定。

1.2.2 原代滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)及傳代：培養(yǎng)絨毛膜滋養(yǎng)層細胞生長至滿瓶壁的85%以上時按1次/3 d傳代。

1.2.3 滋養(yǎng)細胞活性測定：將生長良好的滋養(yǎng)細胞制成細胞懸液移入96孔板,分別加入100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL和0.1 ng/mL 4種不同濃度的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),50 μL/孔,同時設(shè)未加細胞因子的細胞懸液孔作為對照組。

1.2.4 膜磷脂分布的檢測：采用Annexin-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞膜磷脂分布,每個樣本均獲取10000個細胞。

1.2.5 滋養(yǎng)細胞的DNA含量檢測：采用PI單染流式細胞儀檢測滋養(yǎng)細胞的DNA含量。

1.2.6 HCG檢測：采用電化學發(fā)光免疫法進行HCG檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

經(jīng)過人絨毛滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)、形態(tài)學觀察,滋養(yǎng)細胞鑒定、細胞純度鑒定,認為培養(yǎng)的細胞純度超過95%,符合實驗要求,證明細胞培養(yǎng)成功。

2.1 滋養(yǎng)細胞增殖活性檢測結(jié)果

通過MTT A570 nm值反映滋養(yǎng)細胞的增殖活性,低濃度TNF-α (0.1 ng/mL)作用24 h后,細胞A570 nm值明顯高于對照組 (P<0.05)；高濃度TNF-α (1～100 ng/mL) 作用后明顯低于對照組 (P<0.05),見圖1。

圖1 TNF-α對滋養(yǎng)細胞MTT A570 nm值的影響*與對照組相比，P<0.05Fig 1 The effection of TNF-α to trophoblasts cell MTT A570 nm

2.2 膜磷脂分布的檢測結(jié)果

經(jīng)流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI染色法檢測滋養(yǎng)細胞膜膜磷脂分布結(jié)果(圖2)。TNF-α 作用24 h后,與對照組比較在TNF-α低濃度(0.1～1 ng/mL)范圍內(nèi),差異無顯著性意義(P>0.05)；在TNF-α高濃度(10～100 ng/mL)范圍內(nèi),滋養(yǎng)細胞早期凋亡率隨TNF-α 濃度升高而增加(P<0.05)。

圖2 Annexin-V/PI染色法細胞膜磷脂分布檢測Fig 2 Annexin-V/PI dyeability to cytomembrane phospholipids test

2.3 各組滋養(yǎng)細胞DNA含量檢測結(jié)果

對滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)24 h后,對照組細胞周期的G1期是86.2%,G2期是5.4%；加入TNF-α實驗組細胞周期的變化如圖3。結(jié)果提示：在不同濃度的TNF-α作用下,滋養(yǎng)細胞G1期、G2期差異無顯著性意義(P>0.05)；對照組與實驗組分別比較,滋養(yǎng)細胞G2期的比例增加(P<0.05),G1期細胞的比例降低(P<0.05),細胞周期由G1期細胞向G2期移行。

在TNF-α 作用24 h后,對照組和0.1～10 ng/mL濃度的TNF-α G1峰左側(cè)未出現(xiàn)凋亡峰；在10 ng/mL、100 ng/mL濃度的TNF-α 峰左側(cè)出現(xiàn)凋亡峰(圖3),晚期凋亡指數(shù)分別為2.1%和3.6%,其滋養(yǎng)細胞的晚期凋亡指數(shù)與正常對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05),晚期凋亡指數(shù)隨TNF-α 濃度增加而增加(P<0.05)。

圖3 流式細胞儀檢測DNA含量Fig 3 DNA content by flow cytometry assay

2.4 滋養(yǎng)細胞HCG的分泌情況

用TNF-α 作用24 h后,與對照組相比,在0～100 ng /mL濃度范圍內(nèi),隨TNF-α濃度的增加,滋養(yǎng)細胞分泌HCG水平逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

圖4 TNF-α 對滋養(yǎng)細胞HCG分泌的影響*與對照組相比P<0.05

Fig 4 The effection TNF-α to HCG secretion of human trophoblasts

3 討 論

3.1 滋養(yǎng)細胞的特性

胎盤主要由滋養(yǎng)細胞構(gòu)成,其功能依賴于結(jié)構(gòu)的完整性。在妊娠過程中,滋養(yǎng)細胞增殖和凋亡,共同調(diào)節(jié)胎盤的發(fā)育、成熟和老化,以滿足妊娠的需要。但當胎盤發(fā)育障礙時,則可引起多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,如不明原因的RSA、異位妊娠、妊娠高血壓、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩[1,2]等。在妊娠早期,滋養(yǎng)細胞需兩次生理性侵入子宮壁,隨后分化為絨毛滋養(yǎng)細胞(villi chorionic trophocytes,VCTs)和絨毛外滋養(yǎng)細胞(extra villi trophocytes,EVTs)[3]。其中EVTs是具有浸潤能力的滋養(yǎng)細胞,分為浸潤型和非浸潤型[4]。浸潤在時間上限于妊娠早期,空間上限于種植部位的子宮內(nèi)膜、子宮肌層的淺1/3以及相關(guān)的螺旋動脈。早孕滋養(yǎng)細胞對子宮壁的有限侵入是人類妊娠得以正常進行的關(guān)鍵。該侵入過程的調(diào)節(jié)失控將導致一系列的妊娠相關(guān)性疾病。其中滋養(yǎng)層細胞的過度侵入與絨毛膜癌密切相關(guān),滋養(yǎng)細胞增殖和凋亡之間平衡失調(diào),引起滋養(yǎng)細胞侵入不足則會造成不明原因的RSA,滋養(yǎng)細胞增殖與凋亡平衡失調(diào)影響其浸潤過程。胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡在調(diào)節(jié)細胞的增殖,胎盤組織結(jié)構(gòu)和功能完整性上發(fā)揮重要的作用。同時，滋養(yǎng)細胞的凋亡也受到多種因子的調(diào)控,如Bcl-2家族蛋白、Fas-FasL系統(tǒng)及多種細胞因子等[5-8],TNF-α是其中一種重要的調(diào)控滋養(yǎng)細胞生長及功能的細胞因子。

3.2 TNF-α 與滋養(yǎng)細胞增殖及凋亡的關(guān)系

既往研究已發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物的子宮內(nèi)膜細胞的凋亡在著床和胎盤化中過程發(fā)揮重要作用。研究證明，早期自然流產(chǎn)過程中能分泌TNF-α 的細胞聚集于母胎界面,TNF-α 可能在母胎界面局部影響滋養(yǎng)細胞的功能導致流產(chǎn),同時TNF-α 的存在,也可使蛻膜細胞分泌的其他細胞因子水平發(fā)生改變,在一定程度上影響蛻膜細胞的凋亡及胎盤血管重鑄,致妊娠失敗[9]。本研究結(jié)果顯示：低濃度(0.1 ng/mL)的TNF-α 可適度的促進滋養(yǎng)細胞增殖,使滋養(yǎng)細胞正常生長,通過胚泡與子宮內(nèi)膜之間相互作用,促進胚泡在子宮內(nèi)膜的植入。但在早期妊娠,隨著TNF-α濃度的大量增加(本實驗TNF-α濃度1～100 ng/mL),抑制了滋養(yǎng)細胞活性,導致滋養(yǎng)細胞增殖減少,凋亡增加(P<0.05)。這種增殖與凋亡失衡,使胎盤發(fā)育障礙,引起功能異常,不利于胚胎的生長,表現(xiàn)為自然流產(chǎn)?？梢奣NF-α影響滋養(yǎng)細胞的增殖及凋亡細胞之間的平衡、在維持胎盤組織結(jié)構(gòu)和功能完整性上發(fā)揮重要的作用。TNF-α 對細胞凋亡有明顯誘導作用,提示在細胞周期時相分布上,對G2期細胞向G1期移行有一定的阻斷作用。由此推測：正是由于自然流產(chǎn)患者體內(nèi)可能存在了TNF-α異常濃度增高,它抑制滋養(yǎng)細胞增殖,誘導滋養(yǎng)細胞凋亡,才使得胚胎或胎兒不能正常生長而致流產(chǎn)。此研究從基因水平上揭示了自然流產(chǎn)的又一個發(fā)生機理,從而為今后在分子水平上進一步研究不明原因的RSA的發(fā)病機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。對于先兆流產(chǎn)的患者,通過檢測TNF-α水平,可作為臨床上評價先兆流產(chǎn)結(jié)局的指標之一；也可以對有RSA的孕婦再次發(fā)生自然流產(chǎn)的風險進行預測。

3.3 不同染色方法檢測滋養(yǎng)細胞凋亡效果之間的差異

目前，應用FCM進行凋亡細胞檢測的常見方法有：PI單染法、Annexin V-FITC/PI雙染色法、caspase-3活性試驗和DNA斷裂點標記。細胞凋亡早期, Annexin V-FITC/PI雙染法可通過細胞膜膜磷脂分布檢測細胞凋亡[10]。細胞凋亡晚期, PI單染法通過染料PI可穿透細胞膜與DNA結(jié)合,檢測DNA含量,表現(xiàn)為G0/G1期前出現(xiàn)一個亞二倍體的凋亡峰[11],根據(jù)凋亡峰的大小可定量檢測出凋亡的細胞百分數(shù)。

本實驗采用了PI單染法和Annexin V-FITC/PI雙染色法,結(jié)果提示：在細胞凋亡早期,使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測早期細胞凋亡,較PI法敏感性高；此方法快速,定量,可以檢測早期細胞凋亡的改變,具有區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞的能力。使用結(jié)合熒光素FITC的Annexin V和PI染色,能區(qū)別活細胞、凋亡細胞、壞死細胞。PI單染法檢測相對晚期細胞凋亡,但由于細胞凋亡的早期尚未出現(xiàn)DNA片段大量丟失時,細胞的DNA不會出現(xiàn)在凋亡峰中,在細胞凋亡晚期,存在明顯的DNA丟失,另外忽略S期和G2/M期細胞的凋亡,結(jié)果的準確性受到質(zhì)疑,具有一定的局限性,且該方法不能區(qū)分壞死細胞。因此，隨著對細胞凋亡研究深入的展開,檢測凋亡的方法和技術(shù)也將會更敏感,更特異。

3.4 TNF-α與滋養(yǎng)細胞分泌HCG之間的關(guān)系

HCG是妊娠期滋養(yǎng)細胞分泌的一種糖蛋白激素,對維持正常妊娠有重要作用。目前,正常妊娠過程中HCG合成與釋放的機制尚不完全清楚,可能與以下三個因素有關(guān)：滋養(yǎng)細胞(主要是合體滋養(yǎng)細胞)數(shù)量；滋養(yǎng)細胞的氧合度；細胞因子如IL-1、IL-6的刺激作用[12，13]。同時也有研究表明,妊娠中、晚期HCG水平的異常改變與先兆子癇、早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等不良妊娠有關(guān)[14]。

本實驗結(jié)果顯示, TNF-α(0～100 ng/mL)有促進滋養(yǎng)細胞分泌HCG的功能,結(jié)合TNF-α影響細胞增殖及細胞凋亡的結(jié)果,TNF-α促進分泌HCG的功能,可能受滋養(yǎng)細胞生長與凋亡之間平衡影響,使滋養(yǎng)細胞分泌HCG的功能代償性增加[15],推測TNF-α并不直接對滋養(yǎng)細胞HCG的合成與釋放產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,但其確切的調(diào)節(jié)機制尚有待于進一步探討。

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