梁 濱,周旭晨,黃榕翀,朱 皓,王俊杰,葛均波,鄒云增

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011；2.大連市第三人民醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116033；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 心內(nèi)科， 上海 200032)

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)能夠動員骨髓干細胞進入外周血，有助于被動員的干細胞遷移至梗死心肌相關(guān)區(qū)域[1]。由于G-CSF治療為非侵入性治療，因此有可能更廣泛應(yīng)用于心肌梗死及缺血性心臟病的治療[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),粒細胞集落刺激因子(G-CSF)治療可能通過增加梗死區(qū)域新生血管和新生心肌細胞改善心肌梗死后心臟功能，但有關(guān)G-CSF對缺血再灌注后局部心肌凋亡和心肌纖維化的影響研究不多，且研究多選擇小動物模型[4]。因此，本研究主要觀察G-CSF治療對缺血再灌注損傷豬心肌的影響，從而為臨床應(yīng)用提供更多實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑與儀器

重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF，商品名惠爾血)購自麒麟鯤鵬(中國)生物藥業(yè)有限公司，Tunel DeadEndTM檢測試劑盒購自美國Promega公司，Reverse Transcription System 及Access RT-PCR 試劑盒購自Promega公司，歐乃派克(碘海醇)注射液購自AMERICAN HEALTH公司，鉈[201TI]核素注射液購自上海原普同位素科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR反應(yīng)儀購自德國Eppendorf公司，水平電泳儀購自日本MuPid公司，GE Innova 2000數(shù)字平板心血管造影系統(tǒng)購自美國GE公司，PHILIPS-IRIX三探頭單光子發(fā)射型計算機斷層儀購自荷蘭PHILIPS公司。

1.2 實驗方法

健康實驗用小型豬，2～3月齡，體重25～30 kg，雌雄不拘。麻醉狀態(tài)下，以6F AL1造影導(dǎo)管行左、右冠狀動脈造影后，選擇合適的球囊于前降支第一對角支分出后主干處封堵，1 h后撤出球囊使血管再通，再次行前降支血管造影，并以6F豬尾導(dǎo)管行左室造影(圖1)。將存活的12只豬隨機分為對照組和G-CSF治療組，每組6只。G-CSF治療組動物接受G-CSF 5 μg/kg·d-1皮下注射，連續(xù)7 d，而對照組則給予等量生理鹽水皮下注射。術(shù)后阿司匹林(150 mg/d)持續(xù)口服直至處死。所有豬均于動物模型建立后及治療第4周記錄生命體征，同時行冠狀動脈造影、左室造影及201TI-核素單光子放射計算機斷層顯像(SPECT)檢查。由不了解分組的專門技師分析冠狀動脈造影數(shù)據(jù)，計算左室射血分數(shù)(LVEF)評價左室功能，并計算左室壁各區(qū)域運動不良的節(jié)段數(shù)目的變化以評價左室局部收縮功能的變化。心肌核素采集圖像由核醫(yī)學(xué)研究室兩位專門人員應(yīng)用計算機軟件分析。根據(jù)提供的軟件進行圖像重建，采用垂直長軸、短軸及水平長軸3組圖像，圖像分析時將左心室分成17個節(jié)段(基底前壁、基底前側(cè)壁、基底下側(cè)壁、基底下壁、基底下間壁、基底前間壁、心中部前壁、心中部前側(cè)壁、心中部下側(cè)壁、心中部下壁、心中部下間壁、心中部前間壁、心尖部前壁、心尖部下壁、心尖部側(cè)壁、心尖部間隔壁、心尖)(圖2、3)，測定左心室心肌灌注情況。所有豬于術(shù)后4周處死，分離左前降支及其對應(yīng)供應(yīng)區(qū)域心肌，TUNEL法測定梗死邊緣區(qū)心肌細胞凋亡情況，Mallory三色法膠原染色測定邊緣區(qū)心肌纖維化情況，RT-PCR測定Bcl-2和Bax表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0專業(yè)統(tǒng)計分析軟件包建立數(shù)據(jù)庫并進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，自身比較采用配對t檢驗，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有顯著性意義。

圖1 缺血再灌注豬模型制備及G-CSF治療后冠狀動脈造影

圖2 SPECT圖像中左心室的17節(jié)段分法

Fig 2 Seventeen segments of left ventricular from SPECT data

圖3 左心室的節(jié)段分布與冠狀動脈的對應(yīng)關(guān)系

Fig 3 Correspondence between left ventricular regions and coronary artery

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

心肌缺血再灌注模型建立成功并存活12只，隨機分組后，所有實驗豬均未見死亡、心肌梗死、感染以及心力衰竭等不良事件發(fā)生。

2.2 左室造影評價左室功能

與缺血再灌注動物模型制備后即刻相比，缺血再灌注4周時兩組豬LVEF均明顯提高(圖4，P<0.01)，但G-CSF治療組LVEF改善程度與對照組相比差異有顯著性意義(圖4，P<0.05)。同時，G-CSF治療4周后左室各區(qū)域運動不良的節(jié)段數(shù)目明顯下降，由29.4±12.7減少至20.8±10.3 (P=0.048)，而對照組則未見這種趨勢(27.9±14.0 vs 25.5±13.6，P=0.178)。

2.3 SPECT評價G-CSF治療后缺血再灌注豬心肌灌注情況

缺血再灌注豬模型建立即刻及術(shù)后4周時進行SPECT檢查發(fā)現(xiàn)，兩組豬心肌原來分布稀疏區(qū)在4周時核素攝取均有所增強，原有的缺損區(qū)域部分放射性填充，缺損面積逐漸縮小，但G-CSF治療后心肌灌注缺損指數(shù)降低幅度明顯高于對照組(圖5，P<0.05)。

2.4 G-CSF動員與心肌細胞凋亡

Tunel染色結(jié)果顯示，G-CSF治療組梗死邊緣區(qū)凋亡心肌細胞數(shù)量明顯少于對照組(圖6)。以DNA ladder Marker為標志，分別在223 bp、327 bp以及597 bp可見擴增條帶，電泳條帶的位置分別與Bax、Bcl-2及GAPDH的理論值相符。G-CSF治療組Bcl-2 mRNA表達高于對照組，而Bax mRNA表達則低于對照組(圖6)。

2.5 G-CSF動員與心肌纖維化

膠原染色(圖7)可見對照組豬4周后梗死邊緣區(qū)心肌纖維排列紊亂不規(guī)則，與正常心肌相比，膠原纖維明顯增多，并呈現(xiàn)交錯狀態(tài)，將心肌纖維分割成島嶼狀，G-CSF治療4周后豬梗死邊緣區(qū)心肌膠原增生較對照組明顯減輕。

圖4 G-CSF治療后4周LVEF變化

圖5 SPECT評價動物模型制備后不同時間心肌灌注缺損面積

CON，對照組；G-CSF，G-CSF治療。*與0周組比，配對t檢驗P<0.05；#與對照組比，Studentt檢驗P<0.05

Fig 5 Myocardial perfusion changes at four-week follow-up after G-CSF treatment by SPECT

3 討 論

本研究證實，皮下注射G-CSF可以改善心肌缺血再灌注后左室局部收縮功能和心肌灌注。這種改善可能與減少心肌凋亡和改善心肌纖維化作用有關(guān)。

盡管隨著藥物治療和介入技術(shù)的不斷提高，急性心肌梗死(AMI)救治成功率不斷提高，但是心肌梗死后遠期心力衰竭依然是無法解決的問題。即便AMI后靶血管迅速開通(<6 h)有助于減少梗死心肌面積，然而病理研究證實心肌梗死后20 min，心肌細胞即出現(xiàn)缺血、壞死，乃至疤痕形成，而靶血管開通后缺血再灌注使得心肌細胞缺血損傷進一步加重，從而引發(fā)一系列病理生理反應(yīng)，導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生。而目前尚缺乏有效的預(yù)防和治療缺血再灌注損傷的方法。因此，尋找新的治療手段成為該領(lǐng)域的熱點話題。近年來，包括作者在內(nèi)的許多研究小組證實干細胞移植可以明顯改善心肌梗死后心臟功能，減少梗死面積，增加局部心肌灌注，同時改善臨床癥狀[5，6]。

圖6 G-CSF治療對心肌凋亡的影響

圖7 治療4周后膠原染色 (×200)A為對照組，B為G-CSF治療組Fig 7 Collagen staining after G-CSF treatment

而粒細胞集落刺激因子(G-CSF)作為骨髓造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)強有力的動員劑，具有同時動員骨髓造血干細胞、間質(zhì)干細胞及內(nèi)皮干細胞釋放進入外周血的能力。之前研究也發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以治療慢性缺血性心臟病，可能與G-CSF抗心肌凋亡和促進局部再血管化有關(guān)[7]。但是，有關(guān)G-CSF治療缺血再灌注損傷的研究不多，且多為小動物實驗，因此本研究中作者利用球囊低壓力擴張封堵前降支后再開通的方法，成功建立缺血再灌注豬模型后，給予G-CSF連續(xù)7 d皮下注射或者生理鹽水注射，4周后通過左室造影和SPECT方法評價左室整體和局部收縮功能。有研究顯示，AMI后“自發(fā)”G-CSF輕度升高有助于干細胞“歸巢”，可能與心肌修復(fù)有關(guān)，但正常狀態(tài)下這種修復(fù)功能很弱。在本研究中作者也發(fā)現(xiàn)，對照組豬心臟功能與模型制備時相比也有一定程度的改善。盡管與對照組相比，G-CSF似乎不能進一步改善整體LVEF，但可以改善左室局部收縮功能并增加局部血流灌注，從而改善心臟功能。RT-PCR測定凋亡相關(guān)因子Bcl-2/Bax mRNA表達結(jié)果顯示，與TUNEL結(jié)果一致，G-CSF治療后損傷心肌邊緣區(qū)域心肌凋亡明顯減少。而且，膠原染色結(jié)果也提示G-CSF可以明顯改善心肌纖維化程度。因此認為，G-CSF可能通過減少心肌細胞凋亡和改善心肌纖維化改善缺血再灌注動物心臟功能，這也為降低AMI遠期心力衰竭發(fā)生率提供了一種新的治療手段。當(dāng)然，本研究動物數(shù)目不多，相關(guān)結(jié)論還需要在更大規(guī)模動物實驗中進一步研究證實。

[1] Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarct heart,improving function and survival[J].PNAS,2001,98:10344-10349.

[2] George JC.Stem cell therapy in acute myocardial infarction:a review of clinical trials[J].Transl Res,2010，155(1):1-9.

[3] Abdel-Latif A,Bolli R,Zuba-Surma EK,et al.Granulocyte colony-stimulating factor therapy for cardiac repair after acute myocardial infarction:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Am Heart J,2008,156(2):216-226.

[4] Higuchi T,Yamauchi-Takihara K,Matsumiya,et al.Granulocyte colony-stimulating factor prevents reperfusion injury after heart preservation [J].Ann Thorac Surg.2008,85(4):1367-1373.

[5] Yao K,Huang RC,Ge JB,et al.Effect of intracoronary bone marrow mononuclear cell administration on chronic myocardial infarction[J].Heart,2008，94(9):1147-1153.

[6] 張飛龍，陳良龍，李淑梅，等.Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子通路介導(dǎo)粒細胞集落刺激因子影響冠狀動脈微栓塞后心肌細胞凋亡的實驗研究[J].中華心血管病雜志，2008，36(3)：254-259.

[7] 黃榕翀，姚康，陸浩，等.經(jīng)冠脈內(nèi)G-CSF注射治療慢性缺血性心臟病的實驗研究[J].中華心血管病雜志，2009,37(8):685-691.