劉建斌

殼聚糖-明膠/β-磷酸三鈣復(fù)合體作為組織工程軟骨支架材料的實驗研究

劉建斌

目的 了解殼聚糖（CS）-明膠（Gel）／β-磷酸三鈣（β-TCP）復(fù)合體支架超微結(jié)構(gòu)、機械性能及生物相容性，探討其作為組織工程軟骨支架材料的可行性。方法 采用二次凍干技術(shù)制備CS-Gel／β-TCP復(fù)合體支架，掃描電鏡觀察超微形態(tài)，材料萬能測試機測定壓縮強度和壓縮模量；將CS-Gel／β-TCP復(fù)合體支架植入兔皮下，觀察體內(nèi)降解情況及生物相容性。結(jié)果 混合溶液固含量、β-TCP添加量、預(yù)凍溫度對復(fù)合體支架的孔隙結(jié)構(gòu)具有決定性作用。β-TCP的引入能顯著增強CS-Gel聚合體支架的機械性，隨著β-TCP添加量的增多，復(fù)合體支架的壓縮強度、模量都有較大程度提高；隨著預(yù)凍溫度的降低，材料的機械性能亦隨之降低。在植入早期可觀察到一過性炎性反應(yīng)，隨著植入時間延長，支架逐漸降解，12周時基本降解吸收。結(jié)論 CS-Gel／β-TCP復(fù)合體支架具有良好的超微結(jié)構(gòu)、機械性能和生物相容性，是一種較好的構(gòu)建組織工程軟骨的支架材料。

組織工程 支架材料 殼聚糖 明膠 β-磷酸三鈣 機械性能 生物相容性

組織工程是利用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和技術(shù)，構(gòu)建具有生命的組織或器官，用于再造或修復(fù)組織缺損的綜合性交叉學(xué)科，支架材料作為人工細胞外基質(zhì)，為功能細胞的黏附、生長提供三維空間[1-2]。本實驗采用二次凍干技術(shù)制備CS-Gel／β-TCP復(fù)合體支架，研究其超微結(jié)構(gòu)、機械性能、降解性及生物相容性，探討其作為組織工程軟骨支架材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（Chitosan，CS）（脫乙酰度＞85%，粘均分子量 15 萬），明膠（Gelatin，Gel）（G9391，Sigma 公司），β-磷酸三鈣（平均粒徑 2.62 μm，比表面積22.91 m2/g，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)院提供），冰醋酸（分析純），檸檬酸（生化試劑），氫氧化鈉（分析純），戊巴比妥鈉。

1.2 方法

1.2.1 支架材料的制備

將CS粉末溶解于2%冰醋酸溶液100 mL中，加入等量的Gel，混勻，40℃水浴，將加入一定量的去離子水的β-TCP攪拌30 min后，溶解于混合溶液中，加入檸檬酸溶液后混勻，倒入塑料平皿。預(yù)冷凍8 h（分別選擇-40℃、-60℃和-80℃），冷凍干燥機真空冷凍干燥48 h，置于2%NaOH水溶液中4 h，中和材料中的殘存冰醋酸后，將其二次凍干，制備成5 mm×5 mm×5 mm的立方體和直徑為10 mm、高15 mm的圓柱體 CS-Gel/β-TCP海綿狀復(fù)合體支架，置于干燥器中備用。兩種形狀的支架依據(jù)β-TCP的添加量（重量分率）分別分為0%組、0.3%組、0.5%組和0.7%組

1.2.2 復(fù)合體支架的孔隙率測定

將復(fù)合體支架置于一定體積的(V1)無水乙醇中，循環(huán)抽真空脫氣泡后，材料和乙醇總體積記為V2，再將復(fù)合體支架移出，剩余乙醇記為V3，則材料孔隙率為：

1.2.3 復(fù)合體支架超微結(jié)構(gòu)觀察

將立方體CS-Gel/β-TCP海綿狀復(fù)合體支架標本真空干燥后，每組標本的橫截面表面噴金，掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 復(fù)合體支架壓縮強度及壓縮模量測定

材料萬能測試機測試圓柱體標本，每組試樣至少測試6個樣品，加載速率0.5 mm／min，抗壓測試加載至試樣變形，記錄最大壓力，計算最大壓縮強度及其壓縮模量（取平均值作為復(fù)合體支架材料的初始壓縮模量）

（式中△N為載荷變量，△L為相對位移變量，L為試樣的長度，A為試樣橫截面面積）

1.2.5 復(fù)合體支架的體內(nèi)降解及生物相容性觀察

取3月齡新西蘭兔6只，3%戊巴比妥耳緣靜脈給藥全身麻醉（1 mL／Kg）。無菌條件下背部正中縱行切口，潛行分離，于不同部位皮下植入4塊立體海綿狀復(fù)合體標本，縫合皮膚。分別于4、8、12周取材， 10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，倒置顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Excel 5.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合體支架一般性狀及孔隙率

二次凍干后的海綿狀復(fù)合體支架呈白色，具有輕微的延展性，孔隙率均約為80%～90%。

2.2 復(fù)合體支架孔隙結(jié)構(gòu)、機械性能的影響因素

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CS-Gel/β-TCP海綿狀復(fù)合體支架有較多微孔，分布均勻?；旌先芤汗毯?、β-TCP添加量和預(yù)凍溫度對復(fù)合支架的孔隙結(jié)構(gòu)起到?jīng)Q定性作用（圖1-3）。強度測試結(jié)果表明，β-TCP的添加對CS-Gel聚合體機械性能的增強效果顯著，隨著β-TCP添加量的增多，復(fù)合體支架的壓縮強度與壓縮模量都有較大程度提高（表1、2）；隨著預(yù)凍溫度的降低其機械性能亦隨之降低（表3）。

表1 混合溶液固含量對復(fù)合體支架機械性能的影響

表2 β-TCP添加量對對復(fù)合體支架機械性能的影響

表3 冷凍溫度對復(fù)合體支架機械性能的影響

2.3 復(fù)合體支架的體內(nèi)降解及生物相容性觀察

2.3.1 大體觀察

實驗動物全部存活，無全身或局部毒性反應(yīng)。皮下植入部位傷口無感染，愈合良好，植入物無脫出。4周時植入物與周圍組織愈合良好，有較硬的膜狀物；8周時植入物與周圍組織邊界不清；12周時植入物基本被纖維結(jié)締組織取代，材料基本被吸收。

2.3.2 組織學(xué)觀察

支架植入后4周，表面有纖維膜包繞，與周圍組織無粘連，內(nèi)部有結(jié)締組織和小血管長入，有部分的片狀復(fù)合體支架材料未吸收，其周圍可見少量淋巴細胞、巨噬細胞(圖4)。8周時，表面有纖維膜包繞，纖維膜變薄，孔隙內(nèi)結(jié)締組織豐富，周圍淋巴細胞、巨噬細胞較4周時更少，支架材料僅少量殘存（圖5）。12周時植入物基本被纖維結(jié)締組織取代，周圍無淋巴細胞、巨噬細胞（圖6）。

圖1 混合溶液固含量對復(fù)合體支架孔隙結(jié)構(gòu)的影響（50×，標尺為500 μm)

圖2 β-TCP添加量對對復(fù)合體支架孔隙結(jié)構(gòu)的影響（50×，標尺為500 μm）

圖3 冷凍溫度對復(fù)合體支架孔隙結(jié)構(gòu)、性能的影響（50×，標尺為500 μm）

圖4 支架植入4周的組織學(xué)觀察（HE）

圖5 支架植入8周的組織學(xué)觀察（HE）

圖6 支架植入12周的組織學(xué)觀察（HE）

3 討論

受損關(guān)節(jié)軟骨的愈合能力非常有限，直徑大于4 mm者極少能自發(fā)修復(fù)。組織工程軟骨為關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)提供了新方法，組織工程軟骨需要具備3個主要條件：①足夠數(shù)量且功能正常的“種子”細胞；②合適的支架材料；③調(diào)節(jié)種子細胞增殖并維持其表型特征的生長因子[3]。其中細胞支架是組織工程軟骨研究的熱點之一。

支架的主要作用是模擬細胞在體內(nèi)的生長空間，為形成軟骨提供種子細胞增殖分化所需的微環(huán)境。理想的支架材料應(yīng)具備良好的組織相容性和多孔的立體結(jié)構(gòu)，微孔的直徑應(yīng)適宜，孔隙率為70%～95%。目前，單一的支架材料都具備理想支架的部分優(yōu)點，但又有著難以克服的缺點，兩種或兩種以上具有互補性的支架材料按一定比例與方式組合，可制備出具有所需結(jié)構(gòu)和性能的三維復(fù)合支架材料。

CS帶正電荷，結(jié)構(gòu)類似于軟骨組織細胞外基質(zhì)的氨基葡萄糖，在體內(nèi)溶菌酶、甲殼酶的作用下降解為氨基葡萄糖單體[4]。具有來源廣泛、生物相容性良好、可塑形、黏附性良好、降解率可控、無免疫原性等諸多優(yōu)點，并具有骨、軟骨引導(dǎo)性，能促進具有成軟骨潛能細胞的分化并有利于軟骨形成。Van deVord等[5]將多孔的CS支架植入小鼠體內(nèi)，觀察到對于CS特異的細胞免疫和體液免疫的水平極低。但CS機械性能差，其降解產(chǎn)物還會使局部pH值降低，導(dǎo)致降解進一步加快并引起炎癥反應(yīng)。

明膠（Gel）是膠原的衍生物，同膠原一樣具有細胞膜整合素結(jié)合區(qū)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸(RGDT)序列和天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(DGEA)序列，具有良好的生物相容性和特異性分子識別，可介導(dǎo)細胞的黏附，對細胞的生長、分化、遷移具有促進作用。Mao等[6]指出，CS抑制細胞進入細胞周期，而CS-Gel則可促進細胞增殖，可能與Gel屏蔽了CS高密度的正電荷有關(guān)。但Gel存在降解速度較快，機械性能差等問題。

β-磷酸三鈣(β-TCP)是一種理想的硬組織替代材料[7]，具有良好的生物相容性、機械性能和降解率，骨、軟骨引導(dǎo)性，其降解產(chǎn)物呈堿性[8]。能中和CS的降解酸性產(chǎn)物，從而消除或減輕CS引起的無菌性炎癥反應(yīng)。王常勇等[9]以β-TCP為支架，接種軟骨細胞后植入裸鼠體內(nèi)，培育出具有三維立體形態(tài)及組織學(xué)特征良好的軟骨組織。但其脆性大、孔隙率偏低、塑形性差。

CS帶正電荷，通過靜電作用與Gel的蛋白分子結(jié)合，增加了CS的親水性，也提高了其透氧性能。但CS-Gel聚合物機械強度不足，而添加β-TCP可提高機械性能。CS與β-TCP在體內(nèi)都是緩慢降解的，而Gel降解很快，可以通過調(diào)整CS、Gel在混合溶液固含量、β-TCP添加量和預(yù)凍溫度，控制降解率使其機械性能與骨、軟骨相匹配。據(jù)此，本實驗以水為致孔劑采用冷凍干燥法制備CS-Gel/β-TCP復(fù)合體支架，采用檸檬酸作為CS的交聯(lián)劑。檸檬酸中的羧基，可與CS中的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，未反應(yīng)的羧基與CS中的氨基相作用形成鹽鍵，交聯(lián)形成有機的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，無細胞毒性。Yin等[10]制備了CSGel/β-TCP復(fù)合多孔支架，兔皮下植入3個月僅見輕微的炎癥反應(yīng)，與本實驗的結(jié)果一致。

綜上所述，CS-Gel／β-TCP復(fù)合體支架具有多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，利于細胞的黏附和生長，具有良好的機械性能，生物相容性，可控的降解率，無酸性降解物，基本符合組織工程軟骨理想支架材料的要求，有潛在的臨床應(yīng)用前景。

[1]Pollok JK,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Semin Pediatr Surg,1996,5(3):191-196.

[2]Sittinger M.Tissue engineering:artificial tissue replacement containing vital components[J].Laryngorhinootologie,1995,74(11):695-699.

[3]馬祖?zhèn)?高長有.軟骨組織工程用材料進展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2O01,l8(4):638-641.

[4]Okemoto Y,Minami S,Matsuhashi A,et al.Application polymeric N-acetyl Dglucosamine(chitin)to veterinary practice[J].Vet Med Sci,1993,55(5):743-747.

[5]Van de Vord PJ,Matthew HW.Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice[J].J Biomed Mater Res,2002,59(3):585-590.

[6]Mao JS,Cui YL.A preliminary study oil chitosan and gelatin polyelectrolyte complex cytocompatibility by cell cycleand apoptosis analysis[J].Biomaterials,2004,25(18):3973-3981.

[7]李朝陽,楊德安,徐廷獻.可降解β-磷酸三鈣的制備及應(yīng)用[J].硅酸鹽通報,2002,21(3):30-39.

[8]Zhang Y,Zhang M.Three-dimensional macroporous calcium phosphate bioceramics with nested chitosan sponges forloadbearing bone implants[J].J Biomed Mater Res,2002,61(1):1-8.

[9]王常勇,薄斌,趙強,等.以磷酸三鈣多孔陶瓷為載體建造組織工程化人工軟骨[J].中華整形外科雜志,2002,18(1):9-11.

[10]Yin Y,Ye F,Cui J,et a1.Preparation and characterization of macroporous chitosan -gelatin／beta -tricalcium phosphate composite scaffolds for bone tissue engineering [J].J Biomed Mater Res,2003,67A(3):844-855.

Experimental Study on Chitosan-Gelatin/β-Tricalcium Complex as Novel Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering

LIU Jianbin.Depattment of Orthopaedics,The Fifth Hospital of Haerbin Medical University,Daqing 163316,China.

ObjectiveTo investigate the ultra－microstructure,physical characteristics and biocompatibility of the manmade porous chitosan(CS)-gelatin(Gel)/β-tricalcium(β-TCP)complex,so as to explore the feasibility of the complex as cartilage tissue engineering scaffolds.MethodsThe CS-Gel/β-TCP sponges were prepared by freezing and lyophilizing taking water as the hole-making agent.The ultra-microstructure was observed with scanning electron microscope.The compress strength and modulus were determined by omnipotent material-testing machine.The complex was subcutaneously imbedded in the rabbit to observe the biodegradability and biocompatibility.ResultsThe solid content of the mixed solution,the affix quantity of β-TCP and the preliminary freeze temperature play the decisive role of the hole structure of the scaffold complex.The compress strength and modulus of the scaffold improved significantly with the affix quantity of β-TCP increased.And the mechanical function reduced when preliminary freeze temperature lowered.Immunological rejection was observed on early stage after embedded.Then the scaffold degraded,and was absorbed at 12 weeks.ConclusionThe CSGel/β-TCP complex scaffold has a 3-D network structure with high porosity,good mechanical function and good biocompatibility.It may be regarded as one of the important cartilage tissue engineering scaffolds with latent value.

Tissue engineering；Scaffold；Chitosan；Gelatin；Beta-tricalcium phosphate；Mechanical function；Biocompatibility

R318.08

A

1673－0364（2010）06－0319－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.005

163318 大慶市，黑龍江 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨科。

2010年10月5日，

2010年12月1日)