吳步猛，林飛燕，趙惠玲，黃卡特，林婷婷，包晶瑩，吳軍，方舟溪，陳國榮

(溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2.生命科學(xué)學(xué)院；3.附屬第一醫(yī)院 病理科；4.電鏡室)

拘束冷應(yīng)激對大鼠腎臟熱休克蛋白表達(dá)和血清皮質(zhì)醇含量的動(dòng)態(tài)影響

吳步猛1，林飛燕2，趙惠玲1，黃卡特3，林婷婷2，包晶瑩2，吳軍2，方舟溪4，陳國榮3

(溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2.生命科學(xué)學(xué)院；3.附屬第一醫(yī)院 病理科；4.電鏡室)

目的：研究拘束冷應(yīng)激對大鼠腎臟組織熱休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）表達(dá)和血清中皮質(zhì)醇（Cortisol，CORT）含量的動(dòng)態(tài)影響及可能的機(jī)制。方法：選取50日齡清潔級大鼠77只，隨機(jī)分為7組，即0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。采用拘束冷應(yīng)激法，應(yīng)激相應(yīng)時(shí)間后，用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠腎臟組織HSP70的表達(dá)，并檢測血清中CORT含量。結(jié)果：血清中的CORT濃度在1.5 h呈現(xiàn)最高值，其余各時(shí)點(diǎn)變化不明顯。光鏡下可見HSP70在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞核及腎小管上皮細(xì)胞的胞核和胞漿中均有表達(dá)。腎臟中HSP70的表達(dá)首先呈增加的趨勢，1.5～2.5 h HSP70持續(xù)高表達(dá)（P＜0.01），之后下降（P＜0.05）。結(jié)論：適當(dāng)強(qiáng)度的拘束冷應(yīng)激能誘導(dǎo)腎臟組織中HSP70的合成，并且隨著時(shí)間的延長而增加，但過度的拘束冷應(yīng)激則可能降低或阻斷腎臟HSP70的表達(dá)。

拘束冷應(yīng)激；大鼠；腎臟；熱休克蛋白；皮質(zhì)醇

當(dāng)動(dòng)物在各種極端環(huán)境因素如雪災(zāi)、地震等造成的寒冷束縛的刺激下，機(jī)體的組織、器官、細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生各種類型的應(yīng)激變化，這些變化能夠反映動(dòng)物的生理狀態(tài)和健康狀態(tài)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在熱暴露、冷暴露和損傷等應(yīng)激條件下，一組應(yīng)激蛋白熱休克蛋白家族（heat shock proteins，HSPs）的表達(dá)水平會顯著增加，HSPs在機(jī)體內(nèi)作為一種分子伴侶而對機(jī)體起到保護(hù)作用[1-2]。以往相關(guān)的實(shí)驗(yàn)多基于慢性冷應(yīng)激，關(guān)于急性冷應(yīng)激對大鼠腎臟組織熱休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響的文獻(xiàn)并不多見。本研究擬用饑餓后急性的拘束冷應(yīng)激法對大鼠進(jìn)行不同強(qiáng)度的應(yīng)激，用免疫組化法觀察大鼠腎臟組織HSP70的表達(dá)，并檢測血清中皮質(zhì)醇（Cortisol，CORT）含量，以期探討?zhàn)囸I后拘束冷應(yīng)激對機(jī)體的影響及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 50日齡清潔級雄性SD大鼠77只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（浙）2005-0019]，質(zhì)量180～230 g。隨機(jī)分為7組，即分別應(yīng)激0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，每組11只。

1.2 拘束冷應(yīng)激模型制作及標(biāo)本制作 大鼠禁食不禁水24 h后，將大鼠四肢束縛于網(wǎng)格板上，限制其活動(dòng)，置于（5±1）℃冰箱內(nèi)急性冷應(yīng)激相應(yīng)時(shí)間后取出，用乙醚深度麻醉，開腹、腹主動(dòng)脈取血、分離血清備用；并快速取3只大鼠腎臟組織2塊，每塊體積約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，置于10%中性福爾馬林中固定24 h以上，水洗、常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片5μm備用。

1.3 血清CORT含量的檢測 采用免疫放射分析（RIA）法測定大鼠血清CORT含量，由溫州醫(yī)學(xué)院迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢測。

1.4 腎組織HSP70的表達(dá) ABC免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。石蠟切片脫蠟水化，新鮮配制的3% H2O2，室溫下孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 nmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）熱修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉20 min；滴加兔多克隆抗體HSP70，稀釋度1:100，4 ℃冰箱過夜；滴加山羊抗兔IgG，37 ℃烤箱孵育30 min，加SABC復(fù)合物，37 ℃ 30 min，DAB光鏡下顯色。實(shí)驗(yàn)以0 h組作為陰性對照。結(jié)果判定以細(xì)胞漿或細(xì)胞核染成黃色或棕褐色為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)觀察區(qū)，采用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統(tǒng)分析免疫組化染色圖像，根據(jù)HSP70陽性反應(yīng)區(qū)域的面積（Area）和累積光密度值（IOD）計(jì)算每一張圖片HSP70陽性表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中CORT含量的變化 前0～1.0 h大鼠血清CORT無明顯變化，1.5 h時(shí)達(dá)到最高值，之后下降但無持續(xù)變化現(xiàn)象。1.5 h組與其他各組之間差異都有顯著性（P<0.05）；其余各組間相比差異都無顯著性（P>0.05）。見表1。

表1 各組血清中CORT濃度的比較（n=8±s）

表1 各組血清中CORT濃度的比較（n=8±s）

與1.5 h組比：*P<0.05，**P<0.01

組別0 h組0.5 h組1.0 h組1.5 h組2.0 h組2.5 h組3.0 h組F CORT（μg/L）19.03±8.51**23.76±4.20*23.98±5.04*46.88±55.09 22.96±6.23*21.78±4.70*22.56±6.08*1.657

2.2 腎臟組織中HSP70表達(dá)的光鏡觀察 見圖1。HSP70在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞核及腎小管上皮細(xì)胞的胞核和胞漿中均有表達(dá)。0 h組大鼠腎臟HSP70也有表達(dá)。隨著冷應(yīng)激時(shí)間的增加HSP70表達(dá)量有所增強(qiáng)：0.5 h組HSP70表達(dá)量增強(qiáng)不明顯；1.0 h組HSP70的表達(dá)量緩慢增強(qiáng)；1.5 h組及2.0 h組HSP70表達(dá)量明顯增強(qiáng)，幾乎每個(gè)細(xì)胞核都有表達(dá)；2.5 h組HSP70表達(dá)量有所減弱，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)范圍有所縮小；3.0 h組HSP70表達(dá)量明顯減弱，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)呈局灶性表達(dá)。

2.3 腎臟組織中HSP70表達(dá)的變化 見表2。各實(shí)驗(yàn)組腎組織中HSP70表達(dá)極顯著地高于0 h組（P<0.01）；0.5、0.1 h 組升高但差異無顯著性（P＞0.05），1.5、2.0、2.5和3.0 h組的HSP70表達(dá)較0.5、0.1 h組明顯升高（P<0.01）；1.5、2.0、2.5 h組間比較差異無顯著性（P＞0.05），但顯著高于3.0 h組（P<0.05），即隨著拘束冷應(yīng)激時(shí)間持續(xù)腎組織HSP70表達(dá)持續(xù)升高，且至1.5～2.5 h呈高表達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，到3.0 h時(shí)有所下降。

表2 各組腎臟組織HSP70表達(dá)的變化（n=3±s）

表2 各組腎臟組織HSP70表達(dá)的變化（n=3±s）

與0h組比：**P<0.01；與0.5h、1.0h組比：##P<0.01；與3.0h組比：△P<0.05，△△P<0.01

Area 44.33±17.99 63.03±32.32**90.57±47.41**176.18± 56.51**##△△176.17± 77.60**##△△173.32± 24.75**##△△139.39±50.30**##△6.024 HSP70 0 h 0.5 h 1.0 h 1.5 h 2.0 h 2.5 h 3.0 h F IOD 7.44±3.36 10.28±5.01**15.46±8.60**29.40 ± 9.70**##△28.71±12.79**##△30.95±3.53**##△23.65±10.32**##6.169

3 討論

圖1 腎臟組織中HSP70表達(dá)的光鏡觀察（ABC，×100）

CORT是下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA）的終末產(chǎn)物，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一種糖皮質(zhì)激素，主要調(diào)節(jié)體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)的代謝。人們發(fā)現(xiàn)各種應(yīng)激原均可以導(dǎo)致外周血或者是組織CORT升高[3]。本研究顯示，血清中的CORT濃度在1.5 h呈現(xiàn)最高值，其余各時(shí)點(diǎn)變化不明顯。此結(jié)果與早期相關(guān)研究相似[4-5]。HSP70幾乎在所有生物的應(yīng)激細(xì)胞中都經(jīng)常高度地被誘導(dǎo)表達(dá)，HSP70賦予細(xì)胞或生物體從應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)的能力，并保護(hù)它們免受應(yīng)激的損害，是對環(huán)境和代謝應(yīng)激綜合反應(yīng)的代表[6]。饑餓是一種強(qiáng)烈的應(yīng)激原，拘束冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作過程中大鼠需經(jīng)24 h饑餓處理[7]，導(dǎo)致0 h組也出現(xiàn)HSP70表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎臟中HSP70的表達(dá)首先呈增加的趨勢，1.5～2.5 h HSP70持續(xù)高表達(dá)，之后下降，提示拘束冷應(yīng)激誘導(dǎo)HSP70的大量表達(dá)從而對處于應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用；光鏡下也可以發(fā)現(xiàn)幾乎每個(gè)細(xì)胞核都有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，隨著應(yīng)激時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，腎臟組織中大鼠HSP70表達(dá)呈顯著下降，此結(jié)果與以往研究并不一致[8]。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們注意到拘束冷應(yīng)激3 h后大鼠都出現(xiàn)體溫下降、虛脫甚至瀕死狀態(tài)，提示此時(shí)組織中HSP70表達(dá)量顯著降低并不是大鼠的“冷適應(yīng)”，而是機(jī)體的衰竭現(xiàn)象，其可能的機(jī)制是當(dāng)嚴(yán)重的傷害性應(yīng)激阻斷了HSP70的轉(zhuǎn)錄和（或）翻譯過程，HSP70無法合成，不能發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡。

CORT與HSP70之間的關(guān)系復(fù)雜，尚無定論。Blake等[9]的研究證實(shí)，HSP70表達(dá)與HPA軸之間存在功能性聯(lián)系，束縛應(yīng)激后3～6 h，大鼠腎上腺皮質(zhì)及胸主動(dòng)脈可見HSP70表達(dá)；切除大鼠垂體后，束縛應(yīng)激后未見HSP70表達(dá)；但給予ACTH后，又可以誘導(dǎo)HSP70表達(dá)。而Vijayan等[10]研究表明，皮質(zhì)醇水平增高，對肝臟HSP70 表達(dá)沒有影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血清中CORT的含量在應(yīng)激初期就升高，之后變化不明顯，而腎臟HSP70表達(dá)量則在應(yīng)激中后期達(dá)到最高，二者間是否存在必然的聯(lián)系有待進(jìn)一步的研究。

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The dynamic effects of cold restraint stress on heat shock protein expression in kidney tissues and serum corticos-teroid content in rats

WU Bumeng*，LIN Feiyan，ZHAO Huiling，HUANG Kate，LIN Tingting，BAO Jingying，WU Jun，F(xiàn)ANG Zhouxi，CHEN Guorong.
*Laboratory Animal Center，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the dynamic effects of cold restraint stress on HSP70 expression in kidney and serum corticosteroid content in rats，and explore its possible mechanism.Methods:Seventy-seven 50-day-old SD rats were randomly divided into 7 groups，namely 0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h and 3.0 h group. At corresponding restraint stress time，the expression of HSP70 in kidney tissues were tested by means of immunohistochemistry and the level of CORT in serum was also examined.Results:The level of CORT reached its peak in 1.5 h group，but there was no significant difference in other groups. Under the light microscope， the expressions of HSP70 in the nuclei of renal glomerular capillary endothelial cells，in the nuclei and cytoplasm of renal tubular epithelial cells could be observed. The HSP70 expression in kidney increased continuously first，then it was kept in a high level at stress time of 1.5 h，2.0 h and 2.5 h（P＜0.01），and since then it declined gradually（P＜0.05）.Conclusion:Suitable cold restraint stress can induce the synthetic of HSP70，and it increased with stress time. While excessive cold restraint stress may decreased or block the expressions of HSP70 in kidney.

cold restraint stress；rats；kidney；heat shock protein 70；Cortisol

Q494

A

1000-2138（2010）06-0564-04

2009-10-27

溫州市科技局科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（Y20060106）；溫州醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目（200801052）。

吳步猛（1971－），男，浙江樂清人，高級實(shí)驗(yàn)師。

吳健敏）

·高教研究·