孫 濤, 銀旭紅, 姚 倩, 周冬香, 邵則淮

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306)

低聚羧甲基殼聚糖的抗氧化性能

孫 濤, 銀旭紅, 姚 倩, 周冬香, 邵則淮

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306)

將低聚殼聚糖(chitosan oligosaccharide, COS)醚化得到O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl chitosan oligosaccharide,O-CMCOS)和N-羧甲基殼聚糖(N-carboxymethyl chitosan oligosaccharide,N-CMCOS), 其取代度(substituting degree, DS)均為0.54, 用紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。同時(shí), 考察了其結(jié)構(gòu)對(duì)超氧陰離子的清除活性以及還原能力。結(jié)果表明, COS及其衍生物清除超氧陰離子的活性及還原能力的強(qiáng)弱順序均為：O-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。

低聚殼聚糖; 羧甲基殼聚糖; 取代度; 抗氧化; 還原能力

甲殼素是自然界存儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的第二大天然多糖, 廣泛存在于甲殼動(dòng)物外殼、某些植物及真菌類細(xì)胞壁中, 其脫乙?；鶠闅ぞ厶恰ぞ厶蔷哂辛己玫纳锵嗳菪?、可生物降解性等多種生物活性, 在食品、化工、環(huán)保和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了重大進(jìn)展[1～3]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)羧甲基化后的一類殼聚糖衍生物。根據(jù)羧甲基的取代位置不同, 可以分為O-羧甲基殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖。羧甲基在多糖主鏈上取代的位置和程度都會(huì)直接影響到羧甲基殼聚糖的各種性能, 是殼聚糖在生產(chǎn)、研究和應(yīng)用中的重要技術(shù)指標(biāo)。有關(guān)羧甲基殼聚糖的取代位置、取代度及其功能之間關(guān)系的研究, 尚未見很多報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以低聚殼聚糖(Chitosan oligosaccharide,COS)為原料, 制備了相同取代度的O-羧甲基殼聚糖(O-CMCOS)和N-羧甲基殼聚糖(N-CMCOS), 并研究了其結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

低聚殼聚糖(分子質(zhì)量為5 ku), 購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司; 魯米諾, 硼氫化鈉, 乙醛酸, 購自Sigma公司; 其余試劑均為分析純, 購自上?；瘜W(xué)試劑公司; 抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。

作為減速器或變速器的傳動(dòng)部件[1],行星機(jī)構(gòu)具有體積小、質(zhì)量輕、結(jié)構(gòu)緊湊、傳動(dòng)速比大、載荷分布均勻以及承載能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于航空、車輛及工程機(jī)械設(shè)備中.在所有行星機(jī)構(gòu)中內(nèi)外嚙合單排行星機(jī)構(gòu)是最基本的組成要素,其設(shè)計(jì)過程要滿足嚴(yán)格的配齒條件,否則將因相互干涉而不能裝配構(gòu)成行星機(jī)構(gòu),最終導(dǎo)致設(shè)計(jì)任務(wù)失敗.本文將基于齒輪傳動(dòng)理論,運(yùn)用數(shù)學(xué)方法討論內(nèi)外嚙合單排行星機(jī)構(gòu)的配齒條件,為工程技術(shù)人員提供成熟的解決方案.

79-3型恒溫磁力攪拌器, 上海司樂儀器有限公司; DELTA-320-S型pH計(jì), 梅特勒-托利多儀器上海有限公司; DDS-307 電導(dǎo)率儀, 上海精密科學(xué)儀器有限公司; UV-2000型紫外可見分光光度計(jì), 尤尼柯上海儀器有限公司; FFM-D型流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀, 西安瑞邁電子科技有限公司;EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀, 德國BRUKER公司。

1.2 羧甲基殼聚糖的制備及表征

1.2.1 O-羧甲基殼聚糖的制備

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行, 采用 KBr壓片法制樣, 測(cè)定波數(shù)范圍為500～4000 cm-1, 分辨率為0.8 cm-1。取代度通過電位滴定法測(cè)得[6]。

1.2.2 N-羧甲基殼聚糖的制備

對(duì)超氧陰離子的清除根據(jù)文獻(xiàn)[7]測(cè)定并稍做改進(jìn)。用pH為10.20的0.5 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制濃度為1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液, 用1×10-3mol/L的鹽酸配制濃度為0.1 mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液, 使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。以緩沖液作為溶劑, 配制成不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液, 讀出峰面積。清除率=(A0－Ai)/A0×100%。式中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經(jīng)SOD、過氧化氫酶及甘露醇檢測(cè), 該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子。

將5.0 g殼聚糖加入到50 mL42%NaOH溶液中,在室溫下邊攪拌邊分別加入5.35、2.5和1.0 g氯乙酸, 反應(yīng)28 h后, 用1∶1 HCl調(diào)節(jié)pH至7, 然后用無水乙醇沉淀并多次浸泡洗滌。最后60 ℃真空干燥,即得到白色的O-羧甲基殼聚糖[4]。

伴隨著同一理性的自我分裂，工具理性的異化成為影響社會(huì)生活的引人矚目的現(xiàn)象，當(dāng)代西方思想家對(duì)其進(jìn)行了深度的批判和反省，彰顯了理性的批判性和超越性力量。

1.3 對(duì)超氧陰離子的清除

將4 g殼聚糖加入到含有0.2 g乙醛酸的150 mL的水溶液中, 攪拌反應(yīng)2 h。用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH至9, 然后加入10 mL10%的NaBH4, 繼續(xù)攪拌2 h,然后調(diào)pH至中性, 然后用無水乙醇沉淀并多次浸泡洗滌, 最后60 ℃真空干燥, 即得到白色的N-羧甲基殼聚糖[5]。

1.4 還原能力的測(cè)定

還原能力根據(jù)文獻(xiàn)[8]測(cè)定并稍做改進(jìn)。取2.0 mL不同濃度的樣品, 加入pH為6.60的0.2 mol/L磷酸緩沖液1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL, 混勻, 50 ℃水浴20 min后迅速冷卻, 加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,混勻后在2000 r/min下離心10 min, 取上清液2.0 mL,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液, 靜置10 min后在700 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜及取代度

圖1 COS, O-CMCOS和N-CMCOS的紅外光譜Fig. 1 FTIR spectra of COS, O-CMCOS and N-CMCOS

2.2 對(duì)超氧陰離子的清除

圖1是COS,O-CMCOS和N-CMCOS的紅外光譜圖。如圖所示, 所有樣品均在1 100 cm-1附近有較強(qiáng)的多糖特征吸收峰。其中1 030 cm-1和1 074 cm-1附近吸收峰分別是分子中伯羥基和仲羥基伸縮振動(dòng)的結(jié)果。這兩個(gè)吸收峰在O-CMCOS譜圖中強(qiáng)度明顯減弱, 由此說明 COS的伯羥基和仲羥基發(fā)生了羧甲基化反應(yīng)。3 400 cm-1-OH吸收峰明顯變窄, 這是由于C6位上-OH發(fā)生了醚化反應(yīng), -OH減少而引起的。在N-CMCOS的譜圖中, 伯胺 N-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)在1 612 cm-1處吸收峰均有減弱, 說明了在N位發(fā)生了羧甲基的取代反應(yīng)[9]。經(jīng)過電位滴定法測(cè)試,O-CMCOS和N-CMCOS的取代度均為 0.54, 這說明羧甲基取代O-CMCOS羥基和N-CMCOS氨基的程度相同。

“農(nóng)區(qū)變景區(qū)、田園變公園、民房變客房”。當(dāng)前，不少地方都把發(fā)展休閑農(nóng)業(yè)和鄉(xiāng)村旅游作為實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的主要抓手，觀光農(nóng)業(yè)園區(qū)、森林人家、康養(yǎng)基地、鄉(xiāng)村民宿等新業(yè)態(tài)層出不窮。例如，北京農(nóng)業(yè)嘉年華、江蘇高淳國際慢城、陜西涇渭茯茶特色小鎮(zhèn)等利用農(nóng)村閑置土地和農(nóng)民閑暇時(shí)間，不僅讓閑置的土地“忙”起來，農(nóng)民的錢包鼓起來，更讓傳統(tǒng)鄉(xiāng)村文化“火”了起來。

第二，時(shí)刻關(guān)注林業(yè)資源的動(dòng)態(tài)變化。木本植物消失、成長(zhǎng)是影響林業(yè)資源整體變化的重要因素，在此基礎(chǔ)上，林業(yè)資源還受到水資源、經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、農(nóng)業(yè)建設(shè)進(jìn)程、相關(guān)部門管理方案等因素的影響。對(duì)此，這就需要林業(yè)部分不定期對(duì)林業(yè)資源進(jìn)行質(zhì)量檢查，深入到森林實(shí)處之內(nèi)進(jìn)行全方位的調(diào)研，從而全面把握林業(yè)資源的總體情況，為林業(yè)局林政資源管理方案的生成提供必要依據(jù)。

圖2 COS、O-CMCOS和N-CMCOS對(duì)超氧陰離子的清除Fig. 2 Scavenging effects of COS, O-CMCOS and N-CMCOS on superoxide anion

2.3 還原能力的測(cè)定

還原能力和抗氧化活性之間有著密切的關(guān)系。抗氧化物質(zhì)通過提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+的轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)出一定的還原能力, 同樣也可以通過提供電子和自由基反應(yīng), 表現(xiàn)出抗氧化活性。COS及其衍生物的還原能力如圖3所示。隨著濃度的增加, 各樣品的吸光值隨之增加, 還原能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí), COS、O-CMCOS和N-CMCOS的吸光度分別是0.72、0.96和0.65。即COS及其衍生物的還原能力大小順序?yàn)椋篛-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。

圖3 COS、O-CMCOS和N-CMCOS的還原能力Fig. 3 Reducing power of COS, O-CMCOS and N-CMCOS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)COS進(jìn)行醚化, 制備了取代度均為 0.54的O-CMCOS和N-CMCOS?？寡趸瘻y(cè)試結(jié)果表明：COS及其衍生物對(duì)超氧陰離子的清除能力與還原能力的順序大小均為：O-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。殼聚糖以及衍生物抗氧化能力的大小與活性羥基和氨基密切相關(guān)。低聚殼聚糖由于主鏈上的β-(1,4)糖苷鍵發(fā)生斷裂, 更多的活性羥基基團(tuán)暴露出來, 因而具有良好的抗氧化能力。在COS分子鏈上引入羧甲基后, 由于-CH2COO-是推電子基團(tuán),它可以使活性羥基和氨基的電子云密度增大, 更有利于活性羥基和氨基與自由基反應(yīng), 故O-CMCOS的抗氧化活性與 COS相比有所增強(qiáng)。而對(duì)于N-CMCOS來說, 羧甲基的引入雖然使活性氨基和羥基的電子云密度增大, 但同時(shí)也減少了游離氨基的含量, 所以N-CMCOS的抗氧化活性相對(duì)最弱。這一結(jié)果也說明氨基在COS及其衍生物抗氧化活性中的重要性。

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Antioxidant activity of carboxymethyl chitosan oligosaccharide

SUN Tao, YIN Xu-hong, YAO Qian, ZHOU Dong-xiang, SHAO Ze-huai
(College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Feb. ,28, 2009

chitosan oligosaccharide; carboxymethyl chitosan oligosaccharide; substituting degree; antioxidant activity; reducing power

O-carboxymethyl chitosan oligosaccharide (O-CMCOS) andN-carboxymethyl chitosan oligosaccharide(N-CMCOS) with the same substituting degree (0.54) of carboxymethyl group were prepared by the etherification of chitosan oligosaccharide (COS), with their structures characterized by FTIR spectra. The orders of COS,O-CMCOS andN-CMCOS scavenging effect on superoxide anion and reducing power wereO-CMCOS＞COS＞N-CMCOS.

TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2010)02-0054-03

2009-02-28;

2009-06-29

上海市教育委員會(huì)科研項(xiàng)目(07zz134); 上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(T1102)

孫濤(1970-), 女, 博士, 副教授, 研究方向：生物化學(xué), 電話：021-61900363, E-mail：taosun@shou.edu.cn

康亦兼)