沈飚 胡興娟 汪云泉 徐君輝

(舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局 浙江舟山 316000)

1 前言

霍亂弧菌引起的急性腸道傳染病,是一種重要的食源性致病菌,在全球爆發(fā)了多次大規(guī)模的疫情,直接危害人類的健康[1]。隨著食品生產(chǎn)和國(guó)際貿(mào)易的迅速發(fā)展,霍亂弧菌檢測(cè)成為了食品安全與質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)普遍采用的培養(yǎng)基只適用于霍亂弧菌的選擇性分離培養(yǎng),不能特異性檢出霍亂弧菌,因此用顯色培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌是一種新的快速方法。

顯色培養(yǎng)基原理是將微生物胞內(nèi)酶的種類及反應(yīng)條件作為微生物分類鑒定的主要依據(jù),通過在分離培養(yǎng)基中加入微生物特異性酶的底物,該底物由發(fā)色基團(tuán)和微生物可代謝物質(zhì)組成,通常無色,但在特異性酶作用下游離出發(fā)色基團(tuán)并顯示一定顏色,直接觀察菌落顏色就可對(duì)菌種做出鑒定,減少了對(duì)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)和進(jìn)一步生化鑒定的步驟[2]。

本文通過比較 Chrom I D Vibrio和 TCBS培養(yǎng)基,對(duì) Chrom I D Vibrio培養(yǎng)基的靈敏度、特異性和檢測(cè)效果進(jìn)行了初步探討。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 培養(yǎng)基及試劑

ChromI D Vibrio顯色培養(yǎng)基 (生物梅里埃 842043001)、TCBS培養(yǎng)基 (北京路橋 080425)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、堿性蛋白胨水、霍亂弧菌生化鑒定管、生物梅里埃V ITEK GN卡、API鑒定條等。

2.1.2 菌株

副溶血弧菌,非 O1霍亂弧菌,溶藻弧菌,創(chuàng)傷弧菌,擬態(tài)弧菌,大腸桿菌,河流弧菌,傷寒沙門氏菌,單增李斯特菌,金黃色葡萄球菌等陽性菌株。

2.1.3 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、電子天平、顯微鏡、-80℃超低溫冰箱、生物梅里埃 V ITEK細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、均質(zhì)器、混勻器等。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)基配制

TCBS培養(yǎng)基的配制按生產(chǎn)廠家說明書進(jìn)行,Chrom I D Vibrio顯色培養(yǎng)基為成品。

2.2.2 顯色培養(yǎng)基特異性

副溶血性弧菌、非 O1霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌采用 2%氯化鈉營(yíng)養(yǎng)瓊脂復(fù)蘇,單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌用腦心浸液瓊脂復(fù)蘇,大腸桿菌、沙門氏菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂復(fù)蘇,復(fù)蘇 20h后用接種環(huán)分別劃線接種 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培養(yǎng) 18～24h,觀察各個(gè)菌株在顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

2.2.3 顯色培養(yǎng)基靈敏度

將非 O1霍亂弧菌大約 3.0×108cfu/mL的增菌液進(jìn)行 10倍梯度稀釋,用移液管吸取 10-5～10-8稀釋度菌液各 l mL,分別涂布 Chrom I D Vibrio和TCBS平板,每個(gè)平板設(shè) 3次重復(fù),36℃培養(yǎng) 18～24h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù),比較各培養(yǎng)基的靈敏度。

2.2.4 人工污染樣品檢驗(yàn)

將非 O1霍亂弧菌大約 3.0×108cfu/mL的增菌液進(jìn)行 10倍梯度稀釋,用移液管吸取 10-5～10-8稀釋度菌液各 1mL分別加入到 10g魚肉 (陰性樣品)中,混勻,按照 SN1022-2001檢驗(yàn)程序,取 1環(huán)增菌液劃線接種 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培養(yǎng)18～24h,觀察霍亂弧菌的檢出情況。

2.2.5 實(shí)際樣品檢驗(yàn)

采集魚肉、魚鰓、蝦、貝類等共 300份,按采樣規(guī)范剪刀取 25g樣品加入 225 mL2%氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌培養(yǎng) 6～8h和 18～24h,分別取 1環(huán)增菌液劃線接種 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培養(yǎng) 18～24 h,觀察。

2.3 鑒定

疑似菌落采用法國(guó)生物梅里埃 V ITEK細(xì)菌鑒定系統(tǒng) GN卡,API、結(jié)合傳統(tǒng)生化方法進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 顯色培養(yǎng)基特異性檢測(cè)結(jié)果

不同菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如表 1所示。在 Chrom I D Vibrio平板上,副溶血性弧菌、河流弧菌呈現(xiàn)粉紅色菌落,非 O1霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌呈現(xiàn)藍(lán)色或者藍(lán)綠色菌落,擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌呈無色菌落,大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等雜菌或生長(zhǎng)很差或被抑制;在 TCBS平板上,副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌都呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落,非 O1亂弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌都呈現(xiàn)黃色菌落,其他雜菌基本不能生長(zhǎng)。

表 1 ChromI D Vibrio培養(yǎng)基檢測(cè)霍亂弧菌特異性實(shí)驗(yàn)

3.2 顯色培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)結(jié)果

采用非O1霍亂弧菌純菌液涂布各平板結(jié)果如表 2,非O1霍亂弧菌純菌液涂布計(jì)數(shù)結(jié)果約為 3.0×108cfu/mL的增菌液,稀釋度為 10-5～10-7的Chrom I D Vibrio、TCBS平板上均能生長(zhǎng),平板靈敏度無明顯差異,在稀釋度為 10-8時(shí),Chrom I D Vibrio能檢測(cè)出目標(biāo)菌,而 TCBS平板未能檢測(cè)。所以 Chrom I D Vibrio培養(yǎng)基的靈敏度比 TCBS的靈敏度要高,檢測(cè)效果比 TCBS好。

表 2 ChromI D Vibrio和 TCBS檢測(cè)霍亂弧菌敏感度對(duì)比試驗(yàn)

3.3 人工污染樣品檢驗(yàn)結(jié)果

非O1霍亂弧菌純菌液涂布計(jì)數(shù)結(jié)果約為 3.0×108cfu/mL的增菌液,稀釋度為 10-5～10-7的純菌液污染魚肉后,檢測(cè)結(jié)果表明,稀釋度 10-5～10-6在 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板上都可以檢出,即當(dāng)樣品中大約有 300cfu/mL濃度的目標(biāo)菌時(shí),經(jīng)過選擇性增菌培養(yǎng),在 2種培養(yǎng)基上都可以檢出,稀釋度 10-7時(shí) Chrom I D Vibrio有檢出、TCBS平板未檢出。

3.4 采集的 300份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)情況

采集的 300份實(shí)際樣品中,包括凍魚肉、帶殼蝦、凍蟹貝等水產(chǎn)品,用 Chrom I D Vibrio與 TCBS檢測(cè),均未檢出目標(biāo)菌。

4 討論

近年來,世界各地不斷發(fā)生微生物引起的食物中毒事件,各國(guó)對(duì)食品衛(wèi)生安全的重視程度越來越高,微生物檢測(cè)力度也在逐步加強(qiáng)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,已經(jīng)不能滿足食品衛(wèi)生安全質(zhì)控的需求,人們不斷嘗試和改進(jìn)檢驗(yàn)技術(shù)和方法。目前對(duì)于顯色培養(yǎng)基的研究已廣泛被應(yīng)用于檢測(cè)沙門氏菌[3]、單核增生李斯特菌[4]、大腸桿菌[5]、金黃色葡萄球菌[6]、副溶血弧菌[7]等致病菌。

本文中 Chrom I D Vibrio培養(yǎng)基根據(jù)弧菌,特別是霍亂弧菌特殊培養(yǎng)條件,加入了選擇性抑菌劑,可以保障霍亂弧菌優(yōu)先生長(zhǎng),抑制其他干擾菌的生長(zhǎng)。大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌均被抑制,具有較好的特異性。與 TCBS相比,減少了干擾性可疑菌株河流弧菌。但霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌顏色基本相同,需要用其他生化反應(yīng)的方法區(qū)分。通過敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Chrom I D Vibrio的對(duì)霍亂弧菌的敏感性高于 TCBS。

綜上所述梅里?；【@色培養(yǎng)基具有良好的靈敏性和特異性,在人工污染樣品的檢測(cè)中,比TCBS平板靈敏性、特異性要好。

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