陸琳 劉來(lái)福 劉國(guó)傳 饒紅 張紹福

(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026)

1 前言

結(jié)核病一直是我國(guó)各口岸檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)實(shí)施衛(wèi)生檢疫的重點(diǎn)疾病,在出入境人員或移民體檢中進(jìn)行肺結(jié)核篩查也是全球結(jié)核病防控重點(diǎn)工作之一。今年新修改的《中華人民共和國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫法實(shí)施細(xì)則》中規(guī)定,傳染性肺結(jié)核病是出入境人員監(jiān)測(cè)傳染病之一,世界衛(wèi)生組織呼吁對(duì)出入境人員或移民進(jìn)行肺結(jié)核篩查和病人分類管理,不少國(guó)家也要求我國(guó)的出境人群必需出具結(jié)核病的檢測(cè)報(bào)告。為了控制結(jié)核病經(jīng)國(guó)境口岸的傳播,各直屬出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心相繼建立結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室,對(duì)出入境人員及移民進(jìn)行結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷[1-2]。

結(jié)核分枝桿菌在衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中被列為第二類病原微生物 (危害程度為Ⅲ級(jí)),屬高致病性病原微生物[3]。結(jié)核分枝桿菌有多種傳播途徑,以呼吸道吸入帶菌的飛沫及帶菌的塵埃為主要傳播途徑,也是引起實(shí)驗(yàn)室感染的最主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì),從事實(shí)驗(yàn)的工作人員感染結(jié)核分枝桿菌的概率是其他行業(yè)工作人員的 3-9倍,結(jié)核分枝桿菌引起的實(shí)驗(yàn)室獲得性感染可發(fā)生于實(shí)驗(yàn)室工作人員操作的整個(gè)過(guò)程中,尤其以在操作過(guò)程中產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠危害最大[4]。

根據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定,涉及結(jié)核桿菌的大量培養(yǎng)、結(jié)核桿菌離心和凍干等可產(chǎn)生氣溶膠的實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)核桿菌活菌感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),應(yīng)在 BSL-3或 ABSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。臨床樣本的結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、生化鑒定、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測(cè)活動(dòng)可在 BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。對(duì)經(jīng)有效方法滅活后不含結(jié)核桿菌活菌材料的分子生物學(xué)、免疫學(xué)等實(shí)驗(yàn)可在 BSL-1實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[5]。國(guó)境口岸結(jié)核病檢測(cè)主要是對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床樣本的操作,可在 BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

目前,對(duì)于結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)制定的檢測(cè)方法大都從檢測(cè)技術(shù)本身進(jìn)行了規(guī)范,但未對(duì)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的生物安全要求進(jìn)行規(guī)范。加強(qiáng)結(jié)核病檢測(cè)的生物安全操作規(guī)范研究,對(duì)于降低實(shí)驗(yàn)室生物安全風(fēng)險(xiǎn),確保實(shí)驗(yàn)室人員生命健康、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,保障社會(huì)公共衛(wèi)生安全和環(huán)境安全等方面具有重要意義[6]。

2 結(jié)核病檢測(cè)易產(chǎn)生生物安全風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及防護(hù)措施

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品的接收與開(kāi)啟

風(fēng)險(xiǎn):由臨床獲取的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物或凍干菌種在運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)因試管塞子脫落或破碎;凍干菌種多為真空封口,當(dāng)打開(kāi)凍干物的安瓿時(shí),因?yàn)槠鋬?nèi)部可能處于負(fù)壓,瞬間進(jìn)入的空氣可能使一些菌體產(chǎn)生氣溶膠擴(kuò)散進(jìn)入空氣而造成污染。

防護(hù)措施:要求接受和打開(kāi)樣品的人員應(yīng)當(dāng)了解樣品對(duì)身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預(yù)防措施的培訓(xùn);樣品要在生物安全柜內(nèi)打開(kāi),緩慢向安瓿中加入液體以重懸凍干物,避免出現(xiàn)泡沫;準(zhǔn)備好消毒劑。

2.2 試驗(yàn)樣品涂片

風(fēng)險(xiǎn):用于顯微觀察的培養(yǎng)物、血液、唾液和糞便等樣品在固定和染色時(shí)可能產(chǎn)生氣溶膠;樣品的熱固定不能殺滅所有涂片標(biāo)本中的結(jié)核桿菌;若涂片長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫中可使殘留活菌減少,并僅見(jiàn)于涂片厚的部分,從而提示在熱固定時(shí),痰液對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用。

防護(hù)措施:涂片操作過(guò)程應(yīng)避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險(xiǎn);若涂片不能及時(shí)染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應(yīng)當(dāng)用鑷子拿取,恰當(dāng)儲(chǔ)存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

2.3 結(jié)核桿菌接種培養(yǎng)

風(fēng)險(xiǎn):在結(jié)核桿菌傳代、耐藥檢測(cè)、生化分型實(shí)驗(yàn)以及感染動(dòng)物結(jié)核桿菌再分離試驗(yàn)中均要求進(jìn)行結(jié)核桿菌接種培養(yǎng),在此活動(dòng)中試管開(kāi)封、樣品轉(zhuǎn)移、吸管吹吸、混合等步驟可能產(chǎn)生氣溶膠;在菌體轉(zhuǎn)移過(guò)程中,培養(yǎng)物制劑的濺出、潑灑和容器的破碎等也可造成嚴(yán)重污染。

防護(hù)措施:在工作臺(tái)面應(yīng)當(dāng)放置一塊浸有消毒液的布或吸有消毒液的紙,使用后將其高壓滅菌或按感染性廢物處理;微生物接種環(huán)的直徑應(yīng)為 2～3mm并完全封閉,手柄的長(zhǎng)度應(yīng)小于 6cm以減小振動(dòng),或者采用一次性滅菌棉簽;用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)能夠避免在明火上加熱所引起的感染性物質(zhì)爆濺;最好使用不需要進(jìn)行消毒的一次性接種環(huán)。

2.4 實(shí)驗(yàn)樣品研磨

風(fēng)險(xiǎn):使用勻漿器時(shí)容器內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氣溶膠;玻璃可能破碎而釋放感染性物質(zhì)。

防護(hù)措施:要求接受和打開(kāi)樣品的人員應(yīng)當(dāng)了解樣品對(duì)身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預(yù)防措施的培訓(xùn);樣品要在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)。

2.5 未經(jīng)滅活組織標(biāo)本采集

風(fēng)險(xiǎn):含活菌血清與細(xì)胞樣品可能造成污染;帶活菌的玻璃器皿破損、注射器的誤傷而造成血液傳播;樣品的稀釋混勻可能產(chǎn)生氣溶膠。

防護(hù)措施:樣品稀釋在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行;盡可能采用塑料器皿,注射器使用時(shí)針頭必須牢牢固定在注射器上;從帶有橡皮塞瓶中抽取微生物懸液時(shí),應(yīng)該用消毒棉球?qū)⑵靠谂c針頭圍住,以防氣溶膠逸出。

2.6 室內(nèi)空氣、實(shí)驗(yàn)用品以及操作臺(tái)面污染

風(fēng)險(xiǎn):微生物操作過(guò)程對(duì)室內(nèi)空氣、用品以及操作臺(tái)面污染。

防護(hù)措施:試驗(yàn)結(jié)束后立即開(kāi)啟紫外燈對(duì)操作區(qū)和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行照射消毒 2h以上;每次試驗(yàn)操作終止后,必須清理好實(shí)驗(yàn)臺(tái),所有物品歸位并用 75%乙醇溶液或 3-5%石碳酸擦洗實(shí)驗(yàn)臺(tái)和地面。

2.7 菌種以及培養(yǎng)物保藏

風(fēng)險(xiǎn):手污染造成感染性物質(zhì)的食入;與皮膚和眼睛的接觸感染;原始記錄未消毒造成污染;個(gè)人防護(hù)裝備未徹底消毒而造成污染。

防護(hù)措施:實(shí)驗(yàn)室人員在操作時(shí)應(yīng)戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,操作人員要仔細(xì)的用肥皂和清水將雙手洗凈;在任何可能導(dǎo)致潛在傳染性物質(zhì)濺出的操作過(guò)程中,應(yīng)采取防護(hù)措施保護(hù)面部、口和眼。

3 結(jié)核病檢測(cè)的生物安全操作

3.1 標(biāo)本容器

標(biāo)本容器應(yīng)是玻璃和塑料制品,堅(jiān)固,加蓋或加塞蓋好后應(yīng)無(wú)泄漏;容器上應(yīng)粘貼標(biāo)簽以便于識(shí)別,外部不應(yīng)有殘留物;標(biāo)本的要求和說(shuō)明書不應(yīng)卷在容器外面,應(yīng)該分開(kāi)放在防水的袋子里;痰標(biāo)本采用世界衛(wèi)生組織 (WHO)推薦的國(guó)際通用螺旋蓋痰瓶或可密封塑料盒、蠟紙盒收集 (參考規(guī)格:直徑 4cm,高度 2cm)。

3.2 樣本采集

應(yīng)遵循專業(yè)防護(hù)方法,所有操作均應(yīng)戴手套、口罩;應(yīng)由受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員采集病人的樣本;由于當(dāng)患者咳嗽、咳痰時(shí),易產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠,感染周邊人群的幾率較高,故采集痰標(biāo)本時(shí)應(yīng)在遠(yuǎn)離人群的開(kāi)放空間,或通風(fēng)良好的室內(nèi)進(jìn)行;在靜脈抽血時(shí),應(yīng)使用一次性的安全真空采血管取代傳統(tǒng)的針頭和注射器,使血液直接采集到帶塞的運(yùn)輸管和 (或)培養(yǎng)管中,用完后自動(dòng)廢棄針頭。

3.3 標(biāo)本接收

接收標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)安排專門的標(biāo)本接收通道;通道內(nèi)應(yīng)安裝紫外燈,備有消毒劑。

3.4 打開(kāi)包裝

接收和打開(kāi)標(biāo)本的人員應(yīng)了解標(biāo)本對(duì)身體健康的潛在危害,并接受過(guò)專業(yè)防護(hù)的培訓(xùn);標(biāo)本的內(nèi)層容器應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開(kāi),并準(zhǔn)備好消毒劑。

3.5 打開(kāi)標(biāo)本管和取樣

應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)標(biāo)本管;應(yīng)戴手套,并對(duì)眼睛和粘膜進(jìn)行保護(hù) (護(hù)目鏡或面罩)。

3.6 樣品涂片

涂片操作過(guò)程應(yīng)避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險(xiǎn);若涂片不能及時(shí)染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應(yīng)當(dāng)用鑷子拿取,恰當(dāng)儲(chǔ)存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

3.7 避免吸入或接觸感染性物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)室人員在操作時(shí)應(yīng)戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飲食以及儲(chǔ)存食品和飲料;在實(shí)驗(yàn)室,工作人員嘴里不應(yīng)有任何東西 (筆、口香糖);不應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室化妝和裝卸角膜接觸鏡。

3.8 避免感染性物質(zhì)的注入

應(yīng)避免被破損玻璃器皿刺傷所引起的接種感染;盡量以塑料器皿和吸管代替玻璃器皿和吸管;銳器損傷時(shí) (如通過(guò)皮下注射針頭、玻璃吸管及破碎的玻璃),應(yīng)防止意外注入感染性物質(zhì);減少使用注射器和針頭,如可用簡(jiǎn)單工具打開(kāi)瓶塞,然后用吸管取樣;一次性物品應(yīng)丟棄在專用的防/耐穿透的帶蓋容器中。

3.9 防止感染性物質(zhì)的擴(kuò)散

微生物接種環(huán)的直徑為 2～3mm,并完全封閉,柄的長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò) 6cm,以最大限度的減小抖動(dòng),防止被接種物灑落;被處理的廢棄標(biāo)本和培養(yǎng)物,應(yīng)放置在防漏的容器內(nèi) (實(shí)驗(yàn)室廢棄物袋),在丟棄到廢棄物盛器中前,采用高壓滅菌膠帶將頂部固定好,然后進(jìn)行高壓滅菌;工作結(jié)束后,應(yīng)采用適當(dāng)?shù)南緞┣宄ぷ鲄^(qū)的污染。

3.10 標(biāo)本的傳遞與運(yùn)輸

標(biāo)本在設(shè)施內(nèi)的傳遞應(yīng)符合下列要求:

(1)裝有標(biāo)本的容器應(yīng)保持直立,避免意外泄露或溢出;

(2)容器應(yīng)是金屬或塑料制品,能耐高壓滅菌 /化學(xué)消毒劑的作用;

(3)應(yīng)定期清除污染。

4 結(jié)核病檢測(cè)主要生物安全儀器設(shè)備的選用、使用和維護(hù)

4.1 生物安全柜的選用、使用和維護(hù)

4.1.1 選用

生物安全柜是在操作原代培養(yǎng)物、菌毒種及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí),用來(lái)保護(hù)操作者、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及實(shí)驗(yàn)材料,使其避免暴露于上述操作過(guò)程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的安全設(shè)備。國(guó)境口岸結(jié)核病檢測(cè)主要是對(duì)結(jié)核分枝桿菌的臨床樣本進(jìn)行操作,根據(jù)其生物安全風(fēng)險(xiǎn),從保護(hù)人員和實(shí)驗(yàn)對(duì)象的角度考慮,建議選用Ⅱ級(jí)生物安全柜 (即氣溶膠經(jīng) HEPA過(guò)濾器過(guò)濾后,一部分排放出去,一部分再次循環(huán)進(jìn)入安全柜內(nèi),其中:前部開(kāi)口區(qū)的吸入氣流用以保護(hù)操作者的安全,經(jīng) HEPA過(guò)濾的垂直氣流用以保護(hù)樣本,排出的氣流經(jīng) HEPA過(guò)濾是為了保護(hù)環(huán)境),尤其不能使用超凈工作臺(tái)來(lái)代替生物安全柜。

4.1.2 使用

(1)生物安全柜在使用中不能打開(kāi)玻璃觀察擋板。

(2)生物安全柜內(nèi)應(yīng)少放置器材或標(biāo)本,以免影響后部壓力排風(fēng)系統(tǒng)的氣流循環(huán)。

(3)生物安全柜內(nèi)不應(yīng)使用本生燈,防止燃燒產(chǎn)生的熱量干擾氣流,損壞過(guò)濾器;應(yīng)使用微型電加熱器。

(4)所有工作應(yīng)在工作臺(tái)面的中后部進(jìn)行,并能通過(guò)玻璃觀察擋板觀察。

(5)操作者不應(yīng)反復(fù)移出和伸進(jìn)手臂以免干擾氣流。

(6)工作完成后及下班前,應(yīng)用消毒劑對(duì)生物安全柜的表面進(jìn)行擦拭。

(7)工作開(kāi)始前和結(jié)束后,安全柜的風(fēng)機(jī)應(yīng)運(yùn)行 10 min以上。

(8)所有進(jìn)入和移出該系統(tǒng)的物品應(yīng)通過(guò)連接的消毒設(shè)備進(jìn)行消毒。

4.1.3 維護(hù)

應(yīng)定期用 70%醫(yī)用酒精擦拭消毒安全柜的內(nèi)壁和臺(tái)面,保持清潔;當(dāng)生物安全柜被污染后,可用甲醛、過(guò)氧化氫熏蒸法消毒;每年需要檢查和更換消毒用紫外燈;每年應(yīng)更換一次 HEPA過(guò)濾器;定期對(duì)生物安全柜進(jìn)行檢測(cè)或檢定。

4.2 高壓滅菌器的選用、使用和維護(hù)

4.2.1 選用

因?yàn)榻Y(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室涉及高致病性病原微生物操作,因此實(shí)驗(yàn)室對(duì)實(shí)驗(yàn)器械、試劑以及廢棄物必須進(jìn)行高壓滅菌。目前使用比較普遍的高壓滅菌器是高壓蒸汽滅菌器,具有溫度高、熱穿透力強(qiáng),滅菌效果好等特點(diǎn)[7]。

4.2.2 使用

(1)高壓滅菌器屬于一類壓力容器,是涉及生命安全、危險(xiǎn)性較大的特種設(shè)備之一,國(guó)家早已頒布了有關(guān)的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn),操作人員應(yīng)定期參加專門的技術(shù)培訓(xùn),做到持證上崗。

(2)在使用高壓滅菌器時(shí)嚴(yán)禁超溫超壓運(yùn)行,應(yīng)緩慢地加載和卸載,做到“四慢一穩(wěn)”,即慢升溫慢升壓慢降壓慢降溫,恒溫操作時(shí)工藝參數(shù)穩(wěn)定。

(3)嚴(yán)禁帶壓操作,并注意裝載容量,下排氣滅菌器的裝載量不得超過(guò)壓力容器內(nèi)容量的 80%,預(yù)真空滅菌器的裝載量不得超過(guò) 90%且不能小于容器內(nèi)容量的 10%,以防止“小裝量效應(yīng)”。

4.2.3 維護(hù)

按照國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督主管部門規(guī)定,必須定期對(duì)高壓滅菌器進(jìn)行定期檢驗(yàn),包括外部檢驗(yàn)、內(nèi)部檢驗(yàn)和耐壓試驗(yàn)。

4.3 離心機(jī)的選用、使用和維護(hù)

4.3.1 選用

離心機(jī)是借離心力分散液相非均一體系的設(shè)備,它根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同,應(yīng)用強(qiáng)大的離心力使物質(zhì)分散、濃縮和提純。結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡可能選用配備密封吊桶、轉(zhuǎn)子的生物安全型離心機(jī)。

4.3.2 使用

(1)離心機(jī)應(yīng)當(dāng)放在低于使用者能看到離心腔的平均高度位置,以便能夠準(zhǔn)確的安裝轉(zhuǎn)頭和離心吊桶。

(2)離心管和盛放離心標(biāo)本的容器應(yīng)由厚壁玻璃 (塑料)制品制成,并且在使用前應(yīng)檢查是否破損,使用時(shí)應(yīng)用螺旋蓋牢固蓋緊。

(3)離心桶的裝載、平衡、密封和打開(kāi)應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

(4)離心桶和十字軸應(yīng)按質(zhì)量配對(duì),并在裝載離心管后正確平衡。

(5)當(dāng)使用固定角離心轉(zhuǎn)子時(shí),離心管不能裝得過(guò)滿,以防漏液。

4.3.3 維護(hù)

應(yīng)在使用前檢查離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)子部位的腔壁有無(wú)被污染。應(yīng)檢查離心轉(zhuǎn)子和離心桶無(wú)腐蝕和細(xì)微裂痕。每次使用后,應(yīng)清除離心桶、轉(zhuǎn)子和離心機(jī)腔的污染,應(yīng)將離心桶倒置存放使平衡液流干。應(yīng)定期清理離心管座,定期清洗離心杯,并用消毒劑清除污染。

[1] Global Tuberculosis Control:A short update to the 2009 report WHO,2009.

[2] Castro C,González L,Rozo JC,et al.Biosafety evaluation of the DNA extraction protocol for Mycobacterium tuberculosis complex species[J].Biomedica,2009,,29(4):561.

[3] 劉國(guó)傳,劉來(lái)福,張利峰,等.檢驗(yàn)檢疫病原微生物實(shí)驗(yàn)室的生物安全[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,,2009,3:20.

[4] 張利峰,劉來(lái)福,饒紅,等.檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物安全要求的分析研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2009,5:12.

[5] 馬虹,楊修軍,隋達(dá)偉,等.病原微生物實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2010,2:32.

[6] 劉來(lái)福主編.病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理和操作指南[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[7] 王君瑋,王志亮,呂京.二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與運(yùn)行控制指南[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009.