肖霄, 倪元穎, 李淑燕, 胡錦榮, 張京聲, 孫君社, 劉 萍

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

酵母轉化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2體系條件

肖霄, 倪元穎, 李淑燕, 胡錦榮, 張京聲, 孫君社, 劉 萍＊

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

超臨界CO2作為非水相介質對酵母轉化茄尼醇生成輔酶Q10的底物和產物具有良好的溶解作用,但對微生物的存在會產生一定影響,選擇合適的超臨界CO2體系條件有利于輔酶Q10產量的提高。通過研究超臨界CO2流體的壓強、酵母細胞在超臨界CO2流體中的反應時間、添加介質種類以及添加量等條件對粟酒裂殖酵母細胞活性和輔酶Q10產量的影響,確定對酵母細胞生存影響較小并顯著促進輔酶Q10生產的超臨界CO2體系條件為:超臨界CO2壓強為10.5 M Pa,反應時間為16 h,向菌體中添加菌體濕重3倍的培養(yǎng)基,超臨界CO2流體中輔酶Q10的產量達到55.71μg/m L。比液體深層發(fā)酵培養(yǎng)輔酶Q10產量提高97.5%。研究結果表明,通過優(yōu)化酵母轉化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2體系條件,可以顯著提高酵母細胞生成輔酶Q10的能力。

超臨界CO2流體;菌體活性;輔酶Q10;茄尼醇;體系條件

輔酶Q10(CoQ10)是呼吸鏈上一個脂溶性的輔酶,參與呼吸鏈中的電子和質子傳遞,且其還原型醌環(huán)結構可以有效地清除自由基,被廣泛地應用于醫(yī)藥、食品添加劑等領域[1]。茄尼醇與輔酶Q10的側鏈——異戊二烯焦磷酸在結構上有一定的相似性,這為茄尼醇作為前體物質實現CoQ10的微生物轉化提供了理論基礎[2-3]。作者所在的研究組前期研究發(fā)現,利用生物轉化法可以將茄尼醇直接轉化為CoQ10,但由于茄尼醇不溶于水,限制了其進入酵母細胞,顯著影響該物質的轉化率,而生成的產物輔酶Q10也微溶于水,產物在細胞內的積累顯著地抑制其產量的進一步提高。超臨界CO2流體具有良好的溶解能力和傳質特性,Comp ton等[4]在超臨界流體中進行了皺褶假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶催化膽甾醇和乙烯乙酸酯的轉酯化反應研究,膽甾醇在超臨界乙烷中的溶解度提高了600多倍。因此超臨界CO2流體可以一定程度上緩解反應的產物抑制作用,但超臨界CO2流體對微生物的發(fā)酵過程產生的影響說法不一[5-6]。有關粟酒裂殖酵母在超臨界體系中的存活及其轉化茄尼醇生產輔酶Q10的情況在國內外未見報道,本研究結果可為輔酶Q10的生產提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharom yce spromb)2·1794,原菌種購自中科院微生物所,經作者所在研究室紫外聯合亞硝基胍誘變獲得能夠轉化茄尼醇生成CoQ10的菌株S.prombB2·1794-23。HA 121-50-02超臨界設備購自江蘇南通華安超臨界萃取公司,反應釜體積為5 L。CO2(純度99.99%)購自北京京城氣體。Agilent A 1200液相色譜系統購自安捷倫公司,配有SPD紫外檢測器。

1.2 主要培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基(組分g/dL):葡萄糖 2,蛋白胨 2,酵母浸提物 1;p H 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(組分 g/dL):葡萄糖 1.5,蔗糖1.5,蛋白胨 1.0,酵母膏 1.0 ,M gSO40.01,K2HPO40.01,KH2PO40.01;p H 5.0。

1.3 菌體培養(yǎng)物的制備

將粟酒裂殖酵母S.prombB2·1794-23接于種子培養(yǎng)基中,在28 ℃下,以160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h至對數生長期,以體積分數10%的接種量將種子接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(裝于250 m L三角瓶),28℃條件下以160 r/m in振蕩培養(yǎng)18 h至對數生長期。將上述所得發(fā)酵液分別裝入編好序號的50 m L離心管中,每管30 mL,以4 000 r/min離心收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,濾紙上倒置10 s,稱重。

1.4 細胞存活率的測定方法

血球計數板結合美蘭染色法。

1.5 輔酶 Q10的提取及檢測方法

從超臨界CO2體系中取出的細胞,用生理鹽水洗滌一次,以4 000 r/min離心收集菌體,每管中加入10 m L pH 6.0、0.1 mol/L的磷酸緩沖液,加入15 uLβ-巰基乙醇,37℃下置于220 r/min搖床反應1 h;然后每管中加入質量分數2%的蝸牛酶,相同條件搖床中反應3 h。將每管離心收集菌體,加入10 m L丙酮,渦旋混勻后冰浴超聲破碎細胞,超聲功率300 W,超聲5 s,間歇6 s,超聲60次。破碎后以4 000 r/min離心,將上清液倒入圓底燒瓶中真空旋轉蒸發(fā),用 5 m L無水乙醇定容待測。HPLC檢測條件:色譜柱為150 mm×4.6 mm,直徑為5μm的Agilent C18柱,流動相為無水V乙醇∶V水=98∶2,流速 1 mL/min,檢測波長 275 nm,進樣量20μL,柱溫28 ℃。

2 結果與討論

2.1 超臨界CO2條件下反應時間對輔酶 Q10產生菌活性以及輔酶Q10產量的影響

在超臨界設備反應釜內放入收集到的菌體,在溫度為31℃、壓強為7.5 M Pa條件下,分別保壓1、3、5、8、16、19 h 后 ,按 0.25 M Pa/min 的速度卸壓(以此速度卸壓可能導致細胞破裂,但由于卸壓時預期轉化過程已結束,因此不影響所考察過程的結果),測得菌體細胞存活率和輔酶Q10產量。結果表明,在19 h內,細胞存活率變化不大,僅在1～3 h及16～19 h時存活率略低于5～16 h,這可能由于前3個小時是細胞適應高壓厭氧環(huán)境的過程,16～19 h由于長時間處于超臨界CO2高壓厭氧環(huán)境中,細胞中積累的營養(yǎng)物質被迅速消耗,一些代謝酶活性降低,導致部分細胞死亡,且活細胞的繁殖能力有所下降,因此導致細胞存活率降低。1～16 h輔酶Q10產量一直呈上升趨勢,前5小時上升速率較快,可能由于1～3 h細胞處于適應高壓厭氧環(huán)境的階段,在脅迫環(huán)境中會生成大量輔酶Q10用于保護線粒體呼吸鏈[7-8]。3 h后,細胞度過適應期并大量繁殖,因此輔酶Q10迅速積累,在16 h時達到42.36μg/m L。16 h后輔酶Q10產量開始下降,可能由于細胞總數、細胞存活率及部分代謝酶活性都在下降而導致,見圖1。

圖1 反應時間對細胞存活率及輔酶Q10產量的影響Fig.1 Effects of reaction time in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

2.2 超臨界CO2壓強對輔酶 Q10產生菌活性以及輔酶 Q10產量的影響

將收集到的細胞放入31℃超臨界 CO2體系下 ,分別在壓強為 7.5、9、10.5、13.5 M Pa 時保壓反應8 h,按0.25 M Pa/m in的速度卸壓,然后測定菌體細胞存活率和輔酶Q10產量。結果見圖2。

圖2 超臨界CO2壓強對細胞存活率及輔酶 Q10產量的影響Fig.2 Effects of reaction pressure in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

細胞存活率隨壓強沒有明顯變化,可能是在31℃條件下,壓強達到7.5 M Pa以上,CO2都以超臨界流體的形式存在,對細胞存活影響的差異不大。Debs-Louka等人[9]以糞鏈球菌、啤酒酵母、埃希氏大腸桿菌3種微生物為研究對象,發(fā)現3種微生物的失活速度在3.5 M Pa以下對壓強的變化不敏感。Lin H-M等人發(fā)現不同微生物細胞對CO2作用的抵抗力不同,這可能由于不同微生物的細胞壁、細胞膜特性不同,對CO2分子的透過性不同。在壓強低于13.5 M Pa時,粟酒裂殖酵母細胞對壓強變化不敏感,細胞存活率維持在80%～86%。輔酶Q10產量在壓強為10.5 M Pa時達到最大,可能由于在10.5 M Pa條件下,超臨界CO2流體對輔酶Q10的溶解性較好,能更好的消除產物抑制作用,利于輔酶Q10的生成,且在此壓強下細胞存活率為86%,說明大部分細胞可以保持良好的生理活性,因此選擇超臨界CO2體系的壓強為10.5 M Pa時進行反應。

2.3 超臨界CO2體系中反應介質種類及添加量對輔酶 Q10產生菌活性以及輔酶Q10產量的影響

在收集的菌體中分別加入每管菌體濕重1～4倍的蒸餾水、生理鹽水、培養(yǎng)基作為反應介質,將其放在超臨界設備反應釜內,在溫度31℃、壓強7.5 M Pa條件下保持不同時間后,按0.25 M Pa/min的速度卸壓,測得菌體細胞存活率和輔酶Q10產量,結果見圖3。

圖3 不同反應時間下蒸餾水添加量對細胞存活率及輔酶 Q10產量的影響Fig.3 Effects of distilled water in scCO2 on cellssurvival and CoQ10 yield

隨著蒸餾水添加量的增加,細胞存活率與輔酶Q10產量都大致呈下降趨勢,在1、5、8 h時,輔酶Q10產量雖有波動,但總體都低于未添加蒸餾水的樣品。由此說明,在該超臨界CO2體系下,添加蒸餾水不利于菌體保持活性,并相應使輔酶Q10產量減少。原因可能是在超臨界狀態(tài)下含水量增大對細胞膜透性有一定影響,CO2較容易通過細胞膜,進入菌體內,導致細胞內的p H值下降和酶失活。

在1 h和16 h條件下,細胞存活率隨著生理鹽水添加量的增加呈略微下降趨勢;在5 h和8 h條件下,分別在添加3倍和1倍質量的生理鹽水時,細胞存活率略有升高。在輔酶Q10產量方面,與對照未添加生理鹽水的樣品相比,8 h添加2倍生理鹽水時,輔酶Q10產量有較大幅度提高,1 h和5 h影響不明顯,16 h雖然在添加3倍生理鹽水時與其他添加量有明顯提高,但比對照未添加生理鹽水時作用不明顯。出現上述結果的原因可能是在超臨界條件下,生理鹽水中的鈉離子和氯離子在細胞生命代謝中起重要作用,Na+影響細胞內外的滲透壓和電化學梯度平衡,刺激代謝產物 H+釋放到胞液中,改變細胞內外局部的p H值,影響相關酶活,見圖4。

圖4 不同反應時間下生理鹽水添加量對細胞存活率及輔酶 Q10產量的影響Fig.4 Effects of normal saline in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

在1 h條件下,細胞存活率隨著培養(yǎng)基添加量的增加緩慢降低,輔酶Q10產量基本保持平穩(wěn);5 h和8 h條件下添加1倍培養(yǎng)基,細胞存活率略高于其他培養(yǎng)基添加量條件,輔酶Q10產量都隨培養(yǎng)基添加量升高呈下降趨勢后又明顯升高。16 h添加1倍培養(yǎng)基時,細胞存活率明顯下降,之后隨添加量增加變化不大,輔酶Q10產量在添加1倍培養(yǎng)基時亦明顯下降,添加3倍培養(yǎng)基時達到最高,為55.71μg/m L。圖5可能由于細胞在放入超臨界CO2體系較短時間內,未能適應環(huán)境變化,另外細胞培養(yǎng)過程中貯存的營養(yǎng)物質還未被消耗掉,所以培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質對保持其活性的作用不大。隨著反應時間的增長,細胞體內原有的營養(yǎng)物質被消耗,需要培養(yǎng)基補充保持活性和生產輔酶Q10所需營養(yǎng)物質。

圖5 不同反應時間下培養(yǎng)基添加量對細胞存活率及輔酶 Q10產量的影響Fig.5 Effects of culture medium in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

2.4 超臨界CO2體系與液體深層培養(yǎng)對輔酶 Q10產生菌活性以及輔酶 Q10產量的影響

將收集到的菌體中加入菌體濕重3倍的培養(yǎng)基,一組放入搖床中于28℃條件下,以160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h;另外一組放入超臨界設備反應釜內,在31 ℃、壓強7.5 M Pa條件下保持16 h。將兩組取出后測定細胞存活率和輔酶Q10產量,結果見圖6。液體深層培養(yǎng)的酵母細胞存活率略高于超臨界CO2體系,差異不明顯,但超臨界 CO2體系中的輔酶Q10產量比液體培養(yǎng)高出97.5%,證明經過優(yōu)化后的超臨界CO2體系條件可以明顯地促進輔酶Q10產量的提高。

圖6 超臨界CO2體系與液體深層培養(yǎng)對細胞存活率及輔酶 Q10產量的影響Fig.6 Effects of scCO2 and liquid submerged culture on cells survival and CoQ10 yield

3 結 語

超臨界CO2條件下,添加合適的介質如生理鹽水和培養(yǎng)基將有利于細胞的存活和輔酶Q10的生成。有利于粟酒裂殖酵母轉化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2條件是:壓強10.5M Pa、反應時間16 h,添加濕菌體質量3倍的培養(yǎng)基,輔酶Q10產量比液體深層培養(yǎng)提高了97.5%。

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Supercritical CO2Conditions of CoQ10Biotransformation from Solanesol by Schizosaccharom yces prombe

XIAO Xiao, N I Yuan-ying, L IShu-yan, HU Jin-rong, ZHANG Jing-sheng,
SUN Jun-she, L IU Ping＊
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Supercritical CO2(scCO2)as non-aqueous media could well dissolve substrates and products of coenzyme Q10(CoQ10)biotransformation reaction from solanesol,but it also had effects on microbial activity,so appropriate scCO2conditions could imp rove CoQ10yield.The effects of scCO2on the catalytic activity ofSchizosaccharom yces prombe(S.promb)and CoQ10yield in different conditions were studied. The appropriate scCO2conditions which could significantly promote the production of CoQ10and could have little negative effects on the cells survival was:triple of cells’wet weight of culture medium was added into the reaction system.,kept the pressure at 10.5 M Pa for 16 h,the production of CoQ10is 55.71μg/mL,imp roved 97.5%.The results showed that optimization of scCO2reaction system conditions could significantly imp rove the production of CoQ10.

supercritical carbon dioxide,cells activity,CoQ10,solanesol,conditions

＊

劉萍(1970-),女,吉林省吉林市人,工學博士,副教授,主要研究方向為發(fā)酵工程和生物制藥。Email:liuping@cau.edu.cn

TQ 464.8

A

1673-1689(2010)02-0302-05

2009-03-15

北京市自然科學基金項目(5062022)。

(責任編輯:李春麗)