寇秀穎 杜陽吉 徐 勇

（廣東省食品工業(yè)研究所，廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣州 510308）

·基礎(chǔ)研究·

桑葉黃酮類和多糖類化合物的提取及其降血糖作用研究

寇秀穎*杜陽吉 徐 勇

（廣東省食品工業(yè)研究所，廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣州 510308）

從桑葉中提取總黃酮和多糖，并測定其對α-葡萄糖苷酶和豬胰液α-淀粉酶的抑制作用以評估其降血糖功能。結(jié)果表明，桑葉中提取的黃酮類和多糖類化合物對這兩種酶都有較好的抑制作用，并且總黃酮和多糖對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制存在協(xié)同作用，兩者混合對兩種酶的抑制作用更強。

桑葉；黃酮；多糖；降血糖作用；協(xié)同作用

桑葉為?？粕僦参锷 orus alba L.的干燥葉。桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，桑葉性寒、味甘苦，是中醫(yī)清熱解毒之要藥。主治風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭疼，目赤暈花等癥。已有研究表明，桑葉的降血糖效果較為顯著，但是對其降血糖有效成分的確認(rèn)一直存在爭議，有觀點認(rèn)為其降血糖有效成分是黃酮類化合物或多糖類化合物，也有學(xué)者認(rèn)為是生物堿類化合物。為了更有效地開發(fā)和利用桑葉這種天然產(chǎn)物在治療糖尿病方面的藥用價值，本實驗對桑葉中黃酮類化合物和多糖類化合物的提取和純化進行了研究，并對其降血糖功能進行了測定。本研究為桑葉在糖尿病的臨床治療方面提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，也將促進桑葉在功能食品中的開發(fā)和利用。

1 實驗試劑與儀器

1.1 原料與試劑

桑葉，廣東韶關(guān)；Diaion HP-20大孔樹脂，日本三菱公司；葡萄糖及蔗糖，AR級，廣州化學(xué)試劑廠；MECK堿性氧化鋁固相萃取柱，German；各種型號的層析柱；α-葡萄糖苷酶、豬胰液α-淀粉酶以及藍(lán)淀粉，Sigma。

1.2 儀器

UV－6300PC紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；5415D離心機，Eppendorf公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器設(shè)備廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精密實驗設(shè)備有限公司；BSZ-100自動部分收集器，上海青浦滬西儀器廠。

2 桑葉多糖的提取及含量測定

2.1 桑葉多醣含量測定方法

按照參考文獻(xiàn)［6］和［7］的方法，以吸光度D（λ）為縱坐標(biāo)，糖質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：D （λ） =0.053 7ρ+0.035 6，R=0.997 9。表明在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L～10 mg/L具有良好線性關(guān)系。

2.2桑葉多糖的提取及純化

稱取100 g桑葉粉末，按1∶30的料液質(zhì)量比加入去離子水，在80℃恒溫下回流提取3 h，重復(fù)3次。最后過濾提取液，重復(fù)10次，合并濾液后進行濃縮精制。

將3 LDiaion HP-20大孔樹脂裝填于層析柱中，將全部提取液加水稀釋至5 L，用恒流泵緩慢上樣，流速約為0.05 mL/s，用H2O-乙醇體系洗脫（乙醇體積濃度分別為0%、10%、30%、50%、70%、100%）。收集0%～50%組分，合并，濃縮干燥，得到純化后的桑葉多糖8.36 g。其含量測定按2.1方法進行，結(jié)果表明桑葉多糖純度為75.69 g/100 g。

將上述純化的桑葉多糖用10倍質(zhì)量的水溶解，加入多糖溶液1/5體積的氯仿和氯仿1/5體積的正丁醇，攪拌30 min，離心，棄去下層和中間層變性蛋白，上層清液用去離子水補足體積，如此反復(fù)5次，真空濃縮，除去有機溶劑，加入4倍體積的無水乙醇，沉淀過夜，離心。收集沉淀，用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，真空干燥得到精制的淡黃色多糖3.65 g。其含量測定按2.1方法進行，結(jié)果表明桑葉多糖純度為90.34 g/100 g。所得多糖用于活性測定。

3 桑葉黃酮類化合物的提取及含量測定

3.1 總黃酮含量測定方法

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加體積濃度60%乙醇溶解，定容，得標(biāo)準(zhǔn)液(含無水蘆丁0.2 g/L)。分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL到25 mL容量瓶中，用體積濃度60%乙醇定容至6 mL，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液0.75 mL，搖勻，靜置6 min；再加100 g/L硝酸鋁溶液0.75 mL，搖勻，靜置6 min；再加40 g/L氫氧化鈉溶液10 mL，用體積濃度60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min，于500 nm測溶液吸光度。以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，吸光度D（λ）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：D（λ） =8.475 6×ρ-0.057 3，R=0.999 8。

3.2 桑葉黃酮類化合物的提取

稱取100 g桑葉粉末，用體積濃度75%乙醇回流提取3次，每次4 h，重復(fù)10次。減壓濃縮初提液得到灰黑色浸膏。用適量的水溶解浸膏，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，各部分提取液減壓濃縮干燥。

對乙酸乙酯提取物進行硅膠柱層析，用不同體積濃度石油醚乙酸乙酯溶液進行梯度洗脫，通過TLC檢測，將70%～100%部分合并，蒸干待用。

對正丁醇部分先用大孔樹脂Diaion HP-20進行初分，以不同體積濃度甲醇作為洗脫劑，除去正丁醇部分中水溶性的鹽分及多糖類，棄去10%～50%部分，合并70%～100%部分，蒸干待用。

將上述幾部分提取物繼續(xù)用大孔樹脂Diaion HP-20進行純化，以不同體積濃度甲醇作為洗脫劑，合并40%～100%部分，蒸干得到10.32 g黃棕色固體，測定該部分總黃酮含純度92.42 g/100 g，所得總黃酮用于活性測定。

4 桑葉黃酮類和多糖類化合物降血糖作用研究

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑能夠使碳水化合物的消化過程延長在整個小腸進行。由于消化時間的延長，單糖被腸黏膜的吸收緩慢，使餐后血糖升高的幅度降低。如果能夠抑制人體內(nèi)消化系統(tǒng)存在的碳水化合物水解酶即α-葡萄糖苷酶（麥芽糖酶與蔗糖酶）的活性，便可以抑制餐后血糖水平的上升。因此，我們通過測定桑葉黃酮類和多糖類化合物對α-葡萄糖苷酶（麥芽糖酶與蔗糖酶）與豬胰液α-淀粉酶的抑制作用來評價其降血糖功能。

4.1 對α-葡萄糖苷酶抑制作用的測定方法

a） 準(zhǔn)確量取200 μL的蔗糖或麥芽糖溶液，200 μL pH為7的磷酸鉀緩沖液和100 μL待測物溶液制成底物溶液；

b） 向底物溶液加入400 μL α-葡萄糖苷酶溶液，充分混合；

c）將測試樣和空白樣一起放入恒溫槽于37℃下恒溫15 min；

d） 分別加入800 μL2 mol/L的TRIS-HCl緩沖液終止反應(yīng)；

e）將反應(yīng)混合物通過堿性氧化鋁小柱以除去一些酚類物質(zhì)和酸性物質(zhì)；

f）將1 mL的萃取液和4 mL的酚酶試劑充分混合，于37℃恒溫30 min；

g）于490 nm下測定測試樣和空白樣的吸光度D（λ） 值；

h） 計算其抑制率：抑制率（%）=（D（λ）空白－D空白（λ）待測物）/D（λ）空白×100。

4.2 對豬胰液α-淀粉酶抑制作用的測定方法

a） 準(zhǔn)確量取 0.5 mol/L pH為 6.9 Tris-HCl（CaCl2）緩沖液3mL于EP管中；

b） 準(zhǔn)確稱取8 mg藍(lán)淀粉，并將其懸浮在Tris-HCl（CaCl2）緩沖液中制得藍(lán)淀粉懸浮液；

c）將藍(lán)淀粉懸浮液于沸水浴恒溫5 min，然后在37℃恒溫5 min；

d） 將0.2 mL待測物溶液（空白樣用0.2 mL Tris-HCl溶液代替待測物溶液）和0.2 mL PPA溶液加入到藍(lán)淀粉溶液中，混合均勻；

e） 將測試樣和空白樣于37℃下恒溫10 min，將0.1 mL的乙酸溶液加入測試樣和空白樣終止反應(yīng)；

f）將反應(yīng)混合物離心5 min，取上清液待測；

g） 在595 nm下測定測試樣和空白樣的吸光度；

h） 計算抑制率：抑制率（%） =（D（λ）空白－D （λ）待測物）/D（λ）空白×100。

4.3 桑葉黃酮類和多糖對α-葡萄糖苷酶及α-

淀粉酶抑制作用的測定

桑葉黃酮類和多糖類化合物及兩種化合物混合后對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶抑制作用的測定結(jié)果見表1。

表1 抑制作用測定結(jié)果

從表1可以看出，桑葉黃酮類和多糖類化合物對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶均有抑制作用，而當(dāng)二者混合后對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用顯著高于黃酮類和多糖類化合物單獨作用時的抑制作用，說明二者結(jié)合使用在降血糖方面具有協(xié)同作用。

5 結(jié)果與討論

a）本文研究了從桑葉中提取純化黃酮類和多糖類化合物的方法，并測定了其純度。

b）本文測定了桑葉中提取的黃酮類和多糖類化合物對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用，結(jié)果表明黃酮類和多糖類化合物對兩種酶的抑制作用很高，都可能是桑葉中降血糖的主要成分。

c）本文測定了桑葉黃酮類和多糖類化合物對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶抑制活性的協(xié)同作用。結(jié)果表明，桑葉黃酮類和多糖類化合物對α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用存在明顯的協(xié)同作用，兩者混合的抑制作用更強。我們初步認(rèn)為桑葉的降血糖作用可能是多種有效成分共同作用的結(jié)果，但其協(xié)同作用的機理還有待進一步研究。

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Study on antidiabetic offect of flavoinds and polysacchrides from the mulberry leaves

KOUXiu-ying*DUYang-jiXUYong
（Guangdong food industryinstitute，Guangdong provincial food industrypublic laboratory，Guangzhou 510308，China）

The crude flavonoids and polysacchrides were extracted and purified from the mulberry leaves.In order to masure their antidiabetic effect，the enzyme inhibitory effect against rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase of the flavonoids and polysacchrides were studied.The result revealed the flavonoids and polysacchrides demonstrated significant enzyme inhibitory.In addition，the isolated flavonoids and polysacchrides showed synergistic inhibitory capacity to rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase， and the inhibitory effect of flavonoids and polysacchrides was improved significantly.

mulberry leaves； flavoinds； polysacchrides；antidiabetic effect；synergistic effect

*寇秀穎，女，1979年出生，2010年畢業(yè)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)專業(yè)，博士，工程師。

2010-09-16