田泱源 李瑞芳

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

糧食微生物檢測(cè)技術(shù)與防制措施*

田泱源**李瑞芳

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

對(duì)目前最新檢測(cè)和鑒定糧食微生物的方法及原理、糧食微生物防制措施進(jìn)行總結(jié)，以期為糧食儲(chǔ)藏提供指導(dǎo)。

糧食微生物；微生物檢測(cè)；防制措施

糧食微生物是指寄附在糧食和食品上的微生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌類中的真細(xì)菌和放線菌，真菌類中的霉菌、酵母菌以及病毒等，這些微生物寄附在糧食及其制品的表面和內(nèi)部。糧食中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一旦條件合適，微生物就會(huì)通過(guò)分泌水解酶，將糧食中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解，破壞糧食的組織結(jié)構(gòu)，甚至?xí)诩Z食中產(chǎn)生具有強(qiáng)烈毒性和致癌性的毒素，引起糧食產(chǎn)后嚴(yán)重?fù)p失。因此了解當(dāng)前糧食微生物監(jiān)測(cè)體系和防制措施，對(duì)有效減少糧食產(chǎn)后損失是十分必要的。

1 糧食微生物檢測(cè)技術(shù)

糧食微生物檢測(cè)包括定量和定性兩個(gè)方面，定量是指糧食中微生物的數(shù)量測(cè)定；而定性是根據(jù)微生物表現(xiàn)的各種性狀特征，對(duì)微生物的種類進(jìn)行鑒別。

傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)主要以分離純化培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在細(xì)胞水平上從形態(tài)特征、生化反應(yīng)等方面鑒別微生物；新的檢測(cè)技術(shù)包括分子生物學(xué)技術(shù)、免疫技術(shù)、代謝技術(shù)、氣相色譜等技術(shù)，使糧食微生物檢測(cè)技術(shù)向快速、靈敏、特異的方向發(fā)展。

1.1 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法

1.1.1 糧食微生物的分離培養(yǎng)和接種鑒定技術(shù)

這是微生物檢測(cè)鑒定最常用的技術(shù)之一，他利用微生物群體特征進(jìn)行檢測(cè)鑒定。尤其對(duì)于形態(tài)相對(duì)較復(fù)雜的霉菌，往往有一些區(qū)別于其他種類的突出特征，一般可以借助形態(tài)特征進(jìn)行種群鑒定。

由于其簡(jiǎn)便易行，對(duì)設(shè)備要求不高，因此分離培養(yǎng)技術(shù)是最常用的技術(shù)，但其最大的缺點(diǎn)就是需要的周期比較長(zhǎng)，檢測(cè)的結(jié)果具有不準(zhǔn)確性。

1.1.2 電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)

電子顯微鏡又分透射電鏡和掃描電鏡，透射電鏡多用于糧食微生物形態(tài)的觀察，掃描電鏡主要用于細(xì)菌和真菌孢子表面形態(tài)特征觀察。但是這些技術(shù)都需要昂貴的設(shè)備，廣泛應(yīng)用尚有難度。

1.2 分子生物學(xué)技術(shù)

1.2.1 DNA探針技術(shù)

DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，對(duì)某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。應(yīng)用不同病原微生物的DNA探針，進(jìn)行相應(yīng)病原微生物的檢測(cè)。如Chen JC等將食品病原菌Listeria monocytogenes的特異DNA序列經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記后作為探針，檢測(cè)Listeria monocytogenes病原菌，而其他李斯特菌種不能被檢測(cè)，因此，避免了其他菌對(duì)結(jié)果的干擾。目前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測(cè)中得到了應(yīng)用。但是采用DNA探針技術(shù)檢測(cè)微生物無(wú)法區(qū)別糧食中的死菌和活菌，得到的結(jié)果對(duì)糧食微生物堆集程度的判斷會(huì)有一定的偏差。

1.2.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR的基本原理是在體外對(duì)特定的雙鏈DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增，故又稱基因體外擴(kuò)增法。利用PCR精確、微量的優(yōu)點(diǎn)對(duì)某些微生物特異基因進(jìn)行擴(kuò)增，以確定糧食中是否受到這些微生物的污染。現(xiàn)在廣泛利用的有反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） 和熒光定量PCR等。RT-PCR是利用信使RNA（mRNA） 為模板，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶，在4種dNTP存在條件下，合成出DNA鏈，并利用DNA聚合酶將其進(jìn)一步大量擴(kuò)增的技術(shù)。相對(duì)于PCR技術(shù)只能檢測(cè)病原菌染色體來(lái)說(shuō)，RT-PCR檢測(cè)的是病原菌的mRNA，即檢測(cè)活菌的存在。熒光定量PCR又稱實(shí)時(shí)定量PCR（Real-Time PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程和PCR產(chǎn)物的量，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR相比，可檢測(cè)mRNA含量水平，由此可判斷出特定基因的轉(zhuǎn)錄水平。

D'Souza DH等利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)沙門氏菌侵襲宿主相關(guān)基因invA的mRNA水平，判斷食品中致病性沙門氏菌活菌的存在及其侵染能力。蔣魯巖等為同時(shí)測(cè)定糧食中的副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌，建立了基于TaqMan探針的雙重Real-time（實(shí)時(shí)）PCR方法。該方法對(duì)2種細(xì)菌菌液的檢測(cè)敏感度均低于10 cfu/PCR反應(yīng)體系，相關(guān)系數(shù)均為1.00，整個(gè)試驗(yàn)可在2 h內(nèi)完成。

1.2.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過(guò)掃描儀定量分析熒光分布模式，來(lái)確定檢測(cè)樣品中是否存在某些特異微生物?；蛐酒夹g(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測(cè)某一致病菌的各種遺傳學(xué)指標(biāo)。

基因芯片技術(shù)需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，易污染，這也降低了他在實(shí)際工作中的應(yīng)用，因此又構(gòu)建了一種新的納米金基因芯片。直徑為納米范圍的金顆粒或含金的化合物，具有良好的生物兼容性，對(duì)其進(jìn)行修飾后就能標(biāo)記到特定的核酸上，作為信號(hào)報(bào)告分子使用，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且與銀反應(yīng)后可形成比原來(lái)體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通裝置記錄。因此，納米金基因芯片技術(shù)大大提高了基因芯片的靈敏度和適用性。

1.3 免疫技術(shù)

1.3.1 乳膠凝集反應(yīng)

乳膠凝集反應(yīng)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，加上人工大分子的乳膠顆粒，發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。用該方法制成的試劑盒檢測(cè)金黃色葡萄球菌，1 min就可以發(fā)生凝集反應(yīng)。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低、靈敏度和特異性均較高，適用于定性檢測(cè)。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，既可測(cè)抗原，也可測(cè)抗體。ELISA用固相載體吸附抗體（抗原），加待測(cè)抗原（抗體），再與相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體（抗原）進(jìn)行抗原抗體的特異免疫反應(yīng)，生成抗體（抗原） -待測(cè)抗原（抗體） -酶標(biāo)記抗體（抗原）的復(fù)合物，最后再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，通過(guò)定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。陳福生等以曲霉特異性抗體為材料，運(yùn)用酶聯(lián)免疫法對(duì)幾種糧食曲霉的多糖進(jìn)行檢測(cè)，并和平板計(jì)數(shù)法的曲霉菌落數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者有很好的線性關(guān)系。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，靈敏度和特異性均較高，可進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

1.3.3 免疫磁性微球

免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病微生物不但得到分離，而且也得到濃集，達(dá)到了檢測(cè)和鑒定微生物的目的。劉琳琳利用免疫磁性微球1h內(nèi)就可以分離檢測(cè)出金黃色葡萄球菌和鏈球菌，且穩(wěn)定性好，成本低，可以在微生物檢測(cè)方面得到廣泛的應(yīng)用。

1.4 代謝技術(shù)

代謝技術(shù)主要包括生物發(fā)光技術(shù)、電阻抗技術(shù)、放射測(cè)量技術(shù)、微熱量技術(shù)。這些技術(shù)都是通過(guò)測(cè)量微生物新陳代謝過(guò)程中一些特殊現(xiàn)象和物理量的變化來(lái)檢測(cè)微生物的含量。生物發(fā)光技術(shù)利用ATP是熒光素酶發(fā)光的必需底物且呈線性關(guān)系來(lái)測(cè)定ATP的含量，而微生物的特定生長(zhǎng)時(shí)期其ATP含量恒定，因此可以通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)確定微生物的含量。電阻抗技術(shù)的原理是細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中會(huì)將大分子電惰性物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)分解為小分子具有電活性的物質(zhì)，我們可以通過(guò)檢測(cè)電阻抗的變化來(lái)判定細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖特性。放射測(cè)量技術(shù)是通過(guò)測(cè)定引入的放射性14C標(biāo)記來(lái)判斷細(xì)菌的數(shù)量。微熱量技術(shù)是通過(guò)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)熱量的變化進(jìn)行細(xì)菌的檢出和鑒別。

1.5 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜法是英國(guó)生物學(xué)家Martin等人于1952年創(chuàng)立的一種物理及物理化學(xué)的分離分析方法。他是一種以氣體為流動(dòng)相，采用沖洗法的柱色譜分離技術(shù)，并與適當(dāng)?shù)蔫b定手段相結(jié)合的一種分離分析方法。其特點(diǎn)是高選擇性、高分離效能、高靈敏度、高速度以及應(yīng)用范圍廣。采用氣相色譜法可以通過(guò)分析細(xì)菌的細(xì)胞成分、體外培養(yǎng)的代謝物等來(lái)檢測(cè)和鑒定微生物。

Schmidt H等采用氣相色譜對(duì)大腸桿菌、藤黃微球菌和巨大芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在保留時(shí)間1.5 min～28 min內(nèi)，每種菌都有15種特定物質(zhì)，這些物質(zhì)的峰大多分布在這段保留時(shí)間內(nèi)，但大約有一半大腸桿菌裂解產(chǎn)物的峰保留時(shí)間大于20 min。根據(jù)細(xì)菌裂解產(chǎn)物的圖譜分析，即可進(jìn)行菌種鑒定。Maddula S等利用氣相色譜技術(shù)測(cè)量細(xì)菌分泌的易揮發(fā)性代謝物的量來(lái)確定大腸桿菌的數(shù)量。

1.6 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳是泛指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道。依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳與傳統(tǒng)的平板電泳方法相比，具有分離柱效高、分析速度快、自動(dòng)化程度高、分析對(duì)象廣、分離模式多等特點(diǎn)。毛細(xì)管電泳已廣泛應(yīng)用于食品微生物的分析檢測(cè)中，與氣相色譜方法相比，具有樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、無(wú)需提取物和方法發(fā)展相對(duì)快等優(yōu)勢(shì)。

毛細(xì)管電泳技術(shù)能將細(xì)菌當(dāng)作“離子”看待。細(xì)菌在一定的生理?xiàng)l件下，其表面基團(tuán)的電離狀態(tài)和雙電層的厚度是電泳緩沖液種類、pH值、離子強(qiáng)度和溫度等參數(shù)的函數(shù)，可以通過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)分離不同種類的細(xì)菌。毛細(xì)管電泳理論指出，分離柱效隨樣品分子擴(kuò)散系數(shù)或分子量的增大而上升，這就預(yù)示著毛細(xì)管電泳在細(xì)胞分離中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Law SW等利用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)食品中的大腸桿菌，比其他的方法均節(jié)約時(shí)間。

1.7 微生物自動(dòng)檢測(cè)儀

隨著微生物快速檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，很多檢測(cè)技術(shù)日趨成熟和完善，并被人們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研制成自動(dòng)或半自動(dòng)微生物檢測(cè)儀。比如最新研制的霉菌快速檢測(cè)裝置就可以檢測(cè)糧食中微生物數(shù)量的變化。其基本原理是當(dāng)霉菌等微生物在糧食中活動(dòng)時(shí)，隨著微生物數(shù)量的增加，酶的活性將提高，利用新研制的檢測(cè)儀可以檢測(cè)糧食樣品中酶活性的變化，即可快速檢測(cè)和判斷出糧食中微生物活動(dòng)的狀況。而且研究表明，儀器檢測(cè)結(jié)果與糧食中實(shí)際微生物數(shù)量變化具有很強(qiáng)的線性相關(guān)。檢測(cè)儀最大的優(yōu)點(diǎn)是可以避免死菌對(duì)于結(jié)果的影響，因?yàn)樗谰遣荒墚a(chǎn)酶的，而酶活力與微生物的數(shù)量是顯著相關(guān)的，所以儀器檢測(cè)的結(jié)果與儲(chǔ)藏糧食中的實(shí)際微生物數(shù)量變化具有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。利用儀器檢測(cè)的缺點(diǎn)是無(wú)法分辨微生物的種類。

2 糧食微生物的防制措施

糧食發(fā)生霉變，不僅影響糧食容重（即糧食所含的能量），而且嚴(yán)重地影響糧食的品質(zhì)，甚至使糧食喪失食用價(jià)值，因此預(yù)防糧食微生物引起的損失主要是防止糧食發(fā)生霉變。防止霉變的措施主要有：

2.1 控制環(huán)境溫度

環(huán)境溫度對(duì)霉菌的生長(zhǎng)、繁殖及存活有著極為重要的作用。各種霉菌均有其最適宜生長(zhǎng)發(fā)育的溫度范圍，在此溫度下霉菌代謝強(qiáng)度高、生長(zhǎng)旺盛、繁殖迅速。當(dāng)超過(guò)最低或最高溫度界限時(shí)，其代謝便會(huì)受到抑制，以致停止生長(zhǎng)或死亡。如曲霉生長(zhǎng)最適溫度一般在30℃左右。一般說(shuō)來(lái)，糧溫在20℃～40℃是大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的適宜溫度；當(dāng)溫度為5℃～15℃，則生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，甚至停滯。因此控制糧堆溫度是防霉的重要措施之一?？刂茰囟仁潜容^容易實(shí)現(xiàn)的一種預(yù)防措施，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。

2.2 控制環(huán)境水分

儲(chǔ)糧環(huán)境中水分條件包括大氣、倉(cāng)房和糧堆的相對(duì)濕度、糧食含水量或水活度（AW）。水分是生物細(xì)胞的主要成分之一，微生物的新陳代謝必需有水的參加。水分是微生物生長(zhǎng)繁殖的基本條件，各種微生物生長(zhǎng)的最低水活度（AW）為：一般細(xì)菌0.90；一般酵母0.88；一般霉菌0.80；一些干生性霉菌0.65。糧食上曲霉屬霉菌孢子萌發(fā)最低AW值為0.65～0.78；青霉屬霉菌為0.79～0.81。一般說(shuō)來(lái)、糧食水分降至13%以下AW為0.65，才能完全抑制霉菌的活動(dòng)。因此可以通過(guò)控制環(huán)境的水分來(lái)抑制霉菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.3 氣體成分

絕大多數(shù)霉菌是好氧的，在低氧環(huán)境下霉菌生長(zhǎng)速度大為減弱。要達(dá)到完全抑制霉菌生長(zhǎng)，糧堆氧體積分?jǐn)?shù)必須控制在0.2%左右。有人研究當(dāng)糧堆CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)40%以上時(shí)，對(duì)一些霉菌的發(fā)育有抑制作用，在體積分?jǐn)?shù)80%的CO2氣體中，白曲霉、黃曲霉、黑曲霉、雜色曲霉和青霉的生長(zhǎng)可完全抑制，而且也可抑制一些酵母菌的生長(zhǎng)。

因此可以人為地排除糧堆中原有氣體，引入某些惰性氣體如CO2、N2以及這些氣體的混合物，使得糧堆內(nèi)氧含量降低，霉菌在低氧或絕氧情況下就會(huì)停止生長(zhǎng)或受到抑制。在國(guó)外，氣調(diào)儲(chǔ)藏已作為現(xiàn)代儲(chǔ)糧的一種重要方法。

3 展望

民以食為天，食以安為先。面臨嚴(yán)峻的糧食安全問(wèn)題，快速、有效的微生物檢測(cè)技術(shù)和方法是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。目前的糧食微生物檢測(cè)技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，如有的技術(shù)經(jīng)濟(jì)適用，但是耗時(shí)太長(zhǎng)，使用受到限制；有的技術(shù)靈敏度高、特異性好、方便快捷，但由于需要精密昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)，目前不能普及應(yīng)用。目前，國(guó)外多應(yīng)用氣相色譜、液相色譜、毛細(xì)管電泳等技術(shù)檢測(cè)糧食微生物。這些技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但由于所需儀器設(shè)備昂貴，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。因此，尋找新的方便、快捷并可廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法仍是研究的熱點(diǎn)。

目前，雖然已能通過(guò)降低水分含量、補(bǔ)充惰性氣體和控制環(huán)境溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)固定儲(chǔ)糧糧倉(cāng)微生物的控制。但在糧食進(jìn)出口和運(yùn)輸過(guò)程中，火車、汽車、輪船等運(yùn)輸工具由于缺少相應(yīng)的技術(shù)設(shè)備，糧食霉變嚴(yán)重。因此，加強(qiáng)糧食運(yùn)輸過(guò)程中簡(jiǎn)易防霉技術(shù)的研究仍具有重要意義。

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Detection technologies and prevention methods offood and grain microorganism

TIANYang-yuan**LI Rui-fang
（College ofbioengineering，Henan universityoftechnology，Zhengzhou 450001，China）

In order to provide valuable advising for food and grain storege，an overview of technologies and their principles of food and grain microorganism detection and identification was given and the prevetion methods were summarized.

food and grain microorganism；microbiological detection technolgy；prevention method

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃（2008051）**田泱源，男，1987年出生，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。

2010-09-02