賀金梅

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

原料預(yù)處理對(duì)檸檬膳食纖維總黃酮的影響

賀金梅*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

以檸檬皮渣為原料，探討不同原料預(yù)處理方法對(duì)檸檬膳食纖維總黃酮的影響，原料進(jìn)行預(yù)處理后經(jīng)冷凍干燥制備膳食纖維，然后進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)測(cè)得經(jīng)滅酶、漂洗、不滅酶不漂洗處理后檸檬皮渣中總黃酮保存率分別為：71.72%、83.79%、92.41%，從結(jié)果可知總黃酮不穩(wěn)定，而溫度是影響總黃酮穩(wěn)定性的重要因素。

檸檬；膳食纖維；總黃酮；脫脂；紫外分光光度計(jì)

檸檬（Citrus Limon） 為蕓香科柑橘屬常綠小喬木，是歐美國(guó)家主栽果樹品種之一。在世界柑橘業(yè)中，檸檬占第三位，年產(chǎn)量約占世界柑橘總產(chǎn)量的9%。我國(guó)的四川、重慶、廣西、云南等地也有分布，栽培品種以尤力克為主，我國(guó)檸檬產(chǎn)量約8萬(wàn)t～10萬(wàn)t，僅占柑橘總產(chǎn)量的1%左右。檸檬含有豐富的檸檬酸、VC、VB、VP、VH、VE、黃酮類、揮發(fā)油、橙皮甙、多種礦物質(zhì)及微量元素等，是一種營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值都極高的水果，具有殺菌、美容、穩(wěn)定情緒、提神、潤(rùn)喉、降低膽固醇、預(yù)防壞血病、防止腎結(jié)石和心血管動(dòng)脈硬化等功效。

檸檬中的黃酮類物質(zhì)含量豐富，較易分離，具有獨(dú)特的芳香性和顯著的藥理學(xué)作用。黃酮類化合物在檸檬的果皮中含量較高，而在果汁中含量較低，僅為1%～5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。黃酮類化合物的生理活性主要有：抗氧化及抗自由基作用；保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用；抗腫瘤、抗癌作用；保護(hù)平滑肌的作用；抗炎、抗菌、抗病毒作用；雌激素作用；保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用；降血糖作用；鎮(zhèn)痛止瀉、防治潰瘍的作用。還可作為功能食品添加劑、天然抗氧化劑使用。因此深度開發(fā)檸檬中豐富的黃酮資源，研究其生理及藥理學(xué)作用，對(duì)于檸檬的深加工及其在醫(yī)藥、保健、食品域的應(yīng)用，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。本研究以檸檬皮渣為原料，探討不同原料預(yù)處理方法對(duì)檸檬膳食纖維總黃酮的影響，以便為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮檸檬，市售；蘆丁，上海同田生物技術(shù)有限公司，純度≥98 g/100 g；石油醚、無(wú)水乙醇、體積濃度95%乙醇、愈創(chuàng)木酚溶液、過氧化氫溶液，成都市科龍化工試劑廠，均為分析純。

1.2 儀器

容量瓶；吸管；離心管；抽濾裝置；Heto-HSC500真空冷凍干燥機(jī)；16目分樣篩，浙江上虞市道墟監(jiān)湖儀器篩具廠；BCD-183A冰箱，合肥榮事達(dá)電冰箱有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀器有限公司；ZN-200A高速中藥粉碎機(jī)，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；玻璃儀器氣流烘干器，長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SFG-02400電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；DZF-6021型真空干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平（TB-214），北京塞多利斯天平有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ-D（III） 循環(huán)水式真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠；WTL超微臺(tái)式離心機(jī)，金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理及膳食纖維制取

檸檬榨汁后取皮渣，對(duì)皮渣進(jìn)行三種處理：①不滅酶也不經(jīng)任何處理直接破碎后再抽濾，抽濾后進(jìn)行冷凍干燥；②滅酶后用流動(dòng)水冷卻，冷卻后再進(jìn)行破碎、抽濾、冷凍干燥；③用30℃溫水洗2次后，再進(jìn)行破碎、抽濾、冷凍干燥。然后在對(duì)三種處理原料制得的膳食纖維進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。其原料預(yù)處理及膳食纖維制取工藝流程如下：

滅酶：要作用是破壞果膠酶，降低果膠的損失，因?yàn)楣z是可溶性膳食纖維，需要盡量保存,用愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)滅酶效果（恒溫90℃滅酶）。其原理是：檸檬中過氧化氫酶的耐熱性比果膠酶的耐熱性強(qiáng)，所以只要檢測(cè)出過氧化氫酶失活了就可以說明果膠酶也已失活了。在有過氧化氫存在時(shí)，過氧化物酶可使愈創(chuàng)木酚氧化成棕紅色的四愈創(chuàng)木酚和水。過氧化物酶通常不單獨(dú)對(duì)過氧化氫分解，只活化其他過氧化物，活化后去氧化多種底物，有些產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生有色反應(yīng)。新鮮檸檬中過氧化物酶活性很強(qiáng)，在過氧化物酶的作用下，能促進(jìn)過氧化氫放出活性很強(qiáng)的氧，氧化愈創(chuàng)木酚，從而使檸檬由無(wú)色變?yōu)榧t棕色。

酶活檢測(cè)方法：①取上述需要滅酶的檸檬皮渣于燒杯中，再將燒杯放在恒溫水浴鍋內(nèi)加熱；②每隔1 min～2 min取燒杯中的皮渣少許進(jìn)行檢驗(yàn)；③向取出的皮渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%愈創(chuàng)木酚溶液，以覆蓋皮渣為宜，振蕩后放置3 min左右；④加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液1～3滴搖勻，稍等片刻，可逐漸觀察到皮渣和溶液的顯色情況；⑤當(dāng)檢測(cè)的皮渣不再變?yōu)榧t棕色時(shí)說明滅酶已徹底。

1.3.2 水分測(cè)定

用烘干法（失重法）測(cè)鮮檸檬和冷凍干燥后檸檬中水分含量。

1.3.3 檸檬膳食纖維中總黃酮含量測(cè)定研究

1.3.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

a） 直接法確定標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大波長(zhǎng)：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.007 7 g，加適量體積濃度30%乙醇，待其溶解后，再以體積濃度30%乙醇定容至100 mL，搖勻備用，質(zhì)量濃度為0.077mg/mL。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品液1.2 mL，用體積濃度30%乙醇定容至10.0 mL，在200 nm～800 nm掃描，確定吸收最大波長(zhǎng)。

b） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為0.077 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，用體積濃度30%乙醇分別定容至10.0 mL，在最大吸收波長(zhǎng)處比色測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 樣品總黃酮含量測(cè)定

a） 樣品處理：準(zhǔn)確稱取1 g～3 g經(jīng)過預(yù)處理干燥后得到檸檬膳食纖維樣品放入50 mL容量瓶中，樣品經(jīng)過脫脂未經(jīng)超聲處理。脫脂即用20 mL石油醚脫脂1 h進(jìn)行前處理。不經(jīng)超聲波處理即先用20 mL體積濃度95%的乙醇浸泡3 h，分離出浸液；再用同體積濃度70%的乙醇浸泡3 h，收集浸液，混合兩次所得浸液，用體積濃度30%乙醇定容至50 mL。然后取混勻樣液20 mL，在3 500 r/min條件下離心10 min，然后各取2.0 mL上清液稀釋定容至50 mL備用。

b）樣品液吸光度測(cè)定：直接將上述稀釋后定容到50 mL的溶液在最大波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，用體積濃度30%乙醇作空白對(duì)照。

式中：y—樣液黃酮含量，mg/mL；

V1—樣液體積，50 mL；

V2—樣品定容體積，50 mL；

V3—量取上清液的體積，2 mL；

m—樣品干基重量，mg。

（1）內(nèi)部污染 內(nèi)部污染具有恢復(fù)難的特點(diǎn)，有以下兩種來(lái)源：①高溫導(dǎo)致淬火冷卻介質(zhì)分子鏈斷裂會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部污染，斷裂下來(lái)的小分子氧化成氣體逸出，斷裂的較大的分子不再有冷卻性能而存在于淬火液中，從而導(dǎo)致淬火液污染。②水的污染，應(yīng)盡量用純度高的自來(lái)水，避免Ca+等離子的混入。

d） 重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平行測(cè)定的結(jié)果,用算術(shù)平均值表示，取3位有效數(shù)字,含量低的保留小數(shù)點(diǎn)后2位。

1.3.3.3 精密性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

a）精密性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取各處理樣品液在3500 r/min條件下離心10 min的上清液2.0 mL分別用體積濃度30%乙醇稀釋定容至50 mL容量瓶中，以體積濃度30%乙醇作空白對(duì)照，依次測(cè)其吸光度。

b） 蘆丁穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液3.0 mL同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定操作，在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min 測(cè)定其吸光度。

c）樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取各處理的樣品液在3 500 r/min條件下離心10 min的上清液2.0 mL，用體積濃度30%乙醇稀釋定容至50 mL容量瓶中，以體積濃度30%乙醇作空白對(duì)照，在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min測(cè)其吸光度。

d）加標(biāo)回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取經(jīng)任意預(yù)處理的樣品1 g（該試驗(yàn)稱取的是經(jīng)30℃溫水處理樣品），樣品同樣經(jīng)過脫脂未經(jīng)超聲處理后收集浸液，混合兩次所得浸液，用體積濃度30%乙醇定容至50 mL。然后取混勻樣液20 mL，在3 500 r/min條件下離心10 min，然后各取10 mL上清液稀釋定容至50 mL備用。

準(zhǔn)確量取上述樣液1.0 mL 9份于9個(gè)容量瓶中并編號(hào) 1、2、3、4、5、6、7、8、9，然后向 9 個(gè)容量瓶依次加入質(zhì)量濃度為0.077 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0mL、1.0mL、1.0mL、1.2mL、1.2 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.4 mL、1.4 mL，然后用體積濃度30%乙醇補(bǔ)充溶液體積至10 mL，依次測(cè)其吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 水分測(cè)定

2.1.1 鮮檸檬中水分測(cè)定

由于在計(jì)算各處理樣品檸檬膳食纖維中總黃酮含量時(shí)需要統(tǒng)一將其含量折算為干基或濕基含量，所以需要測(cè)檸檬中水分，見表1。

表1 鮮檸檬水測(cè)定（n=3）

2.1.2 預(yù)處理冷凍干燥后檸檬膳食纖維中水分測(cè)定

檸檬皮渣經(jīng)過原料預(yù)處理冷凍干燥后，皮渣中仍含有一定水分，真空冷凍干燥并不能將其中所有水分除去，因此需測(cè)出其中水分，見表2。

表2 預(yù)處理冷凍干燥后檸檬膳食纖維中水分測(cè)定（n=3）

2.2 檸檬膳食纖維中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為326 nm。得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=16.926X+0.0008，R2=0.999 9；如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 檸檬膳食纖維中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)預(yù)處理后制得檸檬膳食纖維和鮮檸檬中總黃酮含量測(cè)定數(shù)據(jù)如表3。

2.2.3 精密性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2.3.1 精密性試驗(yàn)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和經(jīng)各預(yù)處理制得檸檬膳食纖維、鮮檸檬總黃酮含量測(cè)定精密性見表4。結(jié)果表明，各樣品吸光度的RSD在合理范圍內(nèi)，說明精密度良好。用此方法測(cè)定檸檬膳食纖維中總黃酮含量結(jié)果可靠。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和經(jīng)各預(yù)處理得到檸檬膳食纖維、鮮檸檬總黃酮含量測(cè)定穩(wěn)定性見表5。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)過滅酶預(yù)處理的樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定，而其他3種樣品在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 各預(yù)處理的檸檬膳食纖維和鮮檸檬中總黃酮含量（n=3）

表4 精密性試驗(yàn)（n=6）

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

數(shù)據(jù)記錄和結(jié)果見表6和表7。測(cè)得9次加標(biāo)回收率平均值=99.33%，RSD=1.17%（n=9），說明該方法測(cè)得的結(jié)果較準(zhǔn)確。

表6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄

表7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.4 結(jié)果與討論

由于黃酮類成分均以2-苯基色原酮為母核結(jié)構(gòu)，而蘆丁也有此結(jié)構(gòu)，因此以蘆丁為對(duì)照檢測(cè)檸檬膳食纖維中總黃酮的含量是科學(xué)的。黃酮類化合物含量測(cè)定方法有HPLC法、紫外分光光度法等。很多文獻(xiàn)報(bào)道總黃酮的含量測(cè)定均以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH為顯色劑進(jìn)行檢測(cè)。但有些黃酮類物質(zhì)在326 nm附近無(wú)最大吸收或吸收很弱，而有些非黃酮類物質(zhì)在326 nm附近有最大吸收或有較強(qiáng)吸收。因此以蘆丁為對(duì)照品，以NaNO2-Al（NO）3-NaOH為顯色劑，于326 nm進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定的方法專屬性不強(qiáng)，有局限性，準(zhǔn)確性較差。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定檸檬膳食纖維中總黃酮含量。從蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蘆丁在0.01 mg/mL～0.04 mg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。從試驗(yàn)結(jié)果可知平均回收率為99.34%，RSD為1.17%（n=9），因此以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定檸檬膳食纖維中總黃酮含量，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。

3 結(jié)論及分析

綜合上述，檸檬皮渣經(jīng)過漂洗、滅酶、不漂洗與不滅酶3種處理后制得的檸檬膳食纖維中總黃酮保存率分別為：83.79%、71.72%、92.41%，說明經(jīng)過滅酶處理后總黃酮的損失最大，經(jīng)過30℃溫水處理?yè)p失次之，未經(jīng)漂洗與滅酶損失的最小。

總黃酮屬于多酚類物質(zhì)，在各種加工處理過程中易發(fā)生酶促褐變，而溫度是影響褐變重要因素，在高溫滅酶期間雖然酚酶被鈍化，但酶被鈍化是需要一定溫度的，在檸檬被加熱到酚酶最高耐熱溫度時(shí)，由于升溫加速了黃酮褐變，所以經(jīng)過滅酶處理后黃酮含量最低。同時(shí)有些類黃酮以糖苷鍵的形式存在檸檬中，因糖苷化使類黃酮水溶性增大，經(jīng)過30℃溫水漂洗會(huì)損失部分黃酮，即測(cè)得黃酮含量較未經(jīng)漂洗與滅酶的樣品小。

［1］ZARGARI A.Medicinal plants［M］.Tehran：Tehran University Press，1990：77-81.

［2］楊恩聰.“尤力克”檸檬在德宏州的表現(xiàn)及栽培技術(shù)［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2006（5）：28-28.

［3］楊恩聰，岳建強(qiáng).德宏檸檬發(fā)展概況及主要栽培技術(shù)［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2006（2）：56-58.

［4］高俊燕，周東果，岳建強(qiáng)，等.德宏檸檬生理落花落果的變化規(guī)律研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（2）：328-331.

［5］石健泉，曾沛繁.檸檬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及栽培管理［J］.廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2006（1）：8-9.

［6］ANONN.Iranian herbal pharmacopoeia［J］.MimstryofHealth Publicafion，2002（1）：114-121.

［7］趙雪梅，朱大元，葉興乾，等.柑桔屬中類黃酮的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（1）：89-92.

［8］張熊祿.微波法從柑桔皮中提取類黃酮［J］.食品科學(xué)，2005，26（3）：119-121.

［9］裴凌鵬，惠伯棣，金宗濂，等.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2004，25（2）：203-207.

［10］阮伸.新橙皮苷結(jié)構(gòu)的波譜分析［J］.江蘇化工，1994，22（3）：36-40.

Study on the effect ofpretreatment on totalflavonoids ofdietary fiber from lemon peel

HE Jin-mei*
(College offood science,Xinan university，Chongqing 400715，China)

The studies on the effect of different pretreatments on the extraction of total flavonoids from lemon peel residue were carried out.After pretreatment of raw materials,the dietary fiber was made by freeze-drying.Then the flavonoids was determined by UV spectrophotometer.Theexperimentresultwas measured after the enzyme inactivating,rinsing,non-enzyme-inactivating and non-rinsing separately.The preservation rates of flavonoids in the lemon dietary fiber were 71.72% ，83.79% ，and 92.41%.Results suggested that flavonoids were not stable,and the temperature was an important factor influencing the stabilityofflavonoids.

lemon； dietary fiber； flavonoids； degrease；UVspectrophotometer

*賀金梅，女，1986年出生，重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)食品學(xué)院在讀研究生。

2010-10-22