摘要選擇COS-7細(xì)胞為研究對象，考察了不同功能化基團修飾的量子點(QDs)與細(xì)胞的非特異性相互作用。結(jié)果表明，氨基聚乙二醇衍生磷脂修飾的量子點(NH2-PEG-QDs)在COS-7細(xì)胞上有強烈的非特異性吸附，其次是羧基聚乙二醇衍生磷脂修飾的量子點(COOH-PEG-QDs)，而甲基聚乙二醇衍生磷脂修飾的量子點(CH3-PEG-QD)在細(xì)胞上的非特異性吸附非常小，并且量子點與細(xì)胞的作用是一個依賴于量子點的濃度、表面電荷、培育時間與溫度，并受培養(yǎng)基中血清影響的耗能過程。

關(guān)鍵詞量子點，細(xì)胞，非特異性吸附

Studies of Nonspecific Interaction between Different Functionalized Quantum Dots and Cells

WANG Qing，ZHANG Peng-fei，YANG Xiao-hai，WANG Ke-min* ，WU Chun-lei

(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Biomedical Engineering Center， Key Laboratory for Bio-Nanotechnology and Molecular Engineering of Hunan Province， Hunan University， Changsha 410082， P.R. China)

AbstractAmino-terminated PEG-phospholipid modified QDs (NH2-PEG-QDs)， carboxyl- terminated PEG-phospholipid modified QDs (COOH-PEG-QDs) and methyl-terminated PEG-phospholipid modified QDs (CH3-PEG-QDs) were prepared by encapsulation of QDs into functional PEG-phospholipid micelles， and their nonspecifical binding to COS-7 cells were investigated. The results indicated that the number of QDs adsorbed on the COS-7 cells increased in the order of CH3-PEG-QDs， COOH-PEG-QDs， NH2-PEG-QDs. The interaction between functionalized QDs and cells was affected by particle concentration， surface charge of functionalized QD， incubation time， temperature and the serum in cell culture medium.

KeywordsQuantum Dots， Nonspecific Adsorption， Cell

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)檢測、生物活性物質(zhì)或細(xì)胞快速分離、藥物可控性定向傳遞和釋放等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景 ， ， ，因此納米材顆粒與細(xì)胞的相互作用受到人們廣泛關(guān)注。納米顆粒與細(xì)胞的相互作用是一個復(fù)雜的過程，該過程除了與納米顆粒本身特性相關(guān)，包括納米顆粒形狀 、大小 、帶電荷量 ， 、表面特性 ， ，以及發(fā)生聚集的能力 等;還和細(xì)胞所處的周期以及細(xì)胞類型密切相關(guān)。

半導(dǎo)體熒光量子點(Quantum Dots， QDs)具有獨特的光學(xué)性質(zhì)，如:吸收光譜寬且連續(xù)，熒光發(fā)射光譜窄而對稱，光學(xué)穩(wěn)定性強，抗光漂白性能好等 ， ， ，非常適合用于細(xì)胞生命過程的可視化研究。

本文使用激光共聚焦熒光顯微鏡研究了活細(xì)胞對不同功能化基團修飾的量子點的非特異性吸附行為，并考察了量子點濃度、培育時間、培養(yǎng)基中的血清及溫度等因素對其的影響，為進一步開展基于量子點的細(xì)胞成像研究與應(yīng)用提供參考。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

硒粉(Se，純度99.5%)、氧化鎘(CdO，純度99.998%)及氧化鋅(ZnO，純度99%)購自德國Alfa Aesar公司;三辛基膦(TOP，純度90%)、三辛基氧化膦(TOPO，純度90%)、油酸(OA，純度90%)和硫粉(S，純度99%)均購自美國Sigma-Aldrich公司;十八胺(ODA，純度97%)和十八烯(ODE，純度90%)購自比利時Acros公司;1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇2000)(COOH-PEG-PE)、1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-氨基(聚乙二醇2000)(NH2-PEG-PE)和1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲基(聚乙二醇2000)(CH3-PEG-PE)購自美國Avanti lipid公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水均為Millipore超純水(18.2 MΩ #8226; cm).非洲綠猴腎細(xì)胞系(COS-7)為本實驗室?guī)齑?，?fù)蘇后用常規(guī)方法接種于15%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基(加青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL)中，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗過程中COS-7細(xì)胞分別接種于玻璃底培養(yǎng)皿中。實驗中所用緩沖溶液均為10 mM PBS緩沖溶液(pH=7.4)。

FV500-IX70激光共聚焦熒光顯微鏡(日本，Olympus公司);Malvern Zetasizer 3000HS分析儀(英國，Malvern公司);Nu-4750E細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國，Nuair公司);UV-1601紫外-可見分光光度計(日本，Shimadzu公司);F-4500熒光光譜儀(日本，Hitachi公司);CS150GX超高速離心機(日本，Hitachi公司)。

1.2實驗過程

1.2.1 量子點表面不同功能化基團的修飾與表征參照文獻(xiàn)[ ]制備CdSe/ZnS量子點，并對量子點表面進行修飾。分別將COOH-PEG-PE、NH2-PEG-PE、CH3-PEG-PE的氯仿溶液和CdSe/ZnS量子點混合于圓底燒瓶中，控制真空度為0.1 Pa，溫度在37 ℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為100 rpm，恒溫減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成一層透明薄膜。然后在圓底燒瓶中加入少量的超純水溶解并將溶液移入超速離心管，使用超高速離心機，在10 ℃，500000 g條件下離心2 h，取紅色沉淀重新分散在超純水中即可分別得到氨基表面(NH2 - PEG - QDs)、羧基表面(COOH - PEG - QDs)、甲基表面(CH3 - PEG - QDs)的磷脂膠束修飾的量子點溶液。按文獻(xiàn)[ ]的方法對修飾后的量子點進行定量，并分別用紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀和Zetasizer分析儀對不同功能基團修飾的量子點進行表征。

1.2.2 不同功能化基團修飾的量子點在細(xì)胞表面的非特異性吸附將細(xì)胞分別與含有不同濃度量子點(終濃度5 ~ 800 nM)的新鮮無血清培養(yǎng)基在37 ℃培育6 h后，用PBS緩沖液洗滌，加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡成像，以研究量子點濃度的影響。

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在37 ℃培育不同時間(0.5 ~ 24 h)后，用PBS緩沖液洗滌，加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡成像，以研究培育時間的影響。

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基和有血清培基在37 ℃孵育18 h后，用PBS緩沖液洗滌，加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡成像，以研究培養(yǎng)基中的血清的影響。

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在不同溫度條件下(4 ℃、10 ℃、25 ℃、37 ℃)孵育18 h后，用PBS緩沖液洗滌，加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基，進行激光共聚焦顯微鏡成像，以研究培養(yǎng)溫度的影響。

2結(jié)果與討論

2.1不同功能化基團修飾的量子點表征

不同功能化基團修飾的量子點的ξ電位分別為+46.4 ± 0.8 mV(NH2-PEG-QDs)，- 1.2 ± 0.8 mV(CH3-PEG-QDs)和-36.1 ± 0.8 mV(COOH-PEG-QDs)。這種電位差別是由于顆粒表面修飾的化學(xué)基團不同所致:NH2-PEG-QDs因其表面的-NH2在水溶液中質(zhì)子化(-NH3+)而帶正電荷，從而表現(xiàn)出較強的正電勢;COOH-PEG-QDs點表面的-COOH在水溶液中去質(zhì)子化(-COO-)而帶負(fù)電荷，因此呈現(xiàn)出較強的負(fù)電勢;對于CH3-PEG-QDs而言，甲基很難因質(zhì)子化或者去質(zhì)子化而帶電荷，但由于該量子點表面修飾有磷脂分子，而磷脂分子帶有負(fù)電荷，使得CH3-PEG-QDs帶少量負(fù)電荷。另外，這三種功能化基團修飾的量子點的熒光發(fā)射波長均為580 nm，和未修飾的量子點熒光光譜一致，說明表面修飾沒有對量子點的熒光特性造成明顯影響(圖1)。

2.2不同功能化基團修飾的量子點與細(xì)胞的非特異性吸附

2.2.1 量子點濃度的影響

考察了不同濃度的NH2-PEG-QDs，COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞作用6 h的情況，結(jié)果如圖2所示。對于NH2-PEG-QDs而言，當(dāng)濃度為50 nM時，細(xì)胞上出現(xiàn)明顯熒光信號，并且隨著量子點濃度的增加而增強，細(xì)胞上的熒光強度也逐漸增加;對于COOH-PEG-QDs而言，當(dāng)濃度達(dá)到100 nM時，可觀察到細(xì)胞上出現(xiàn)熒光信號，其強度也隨著量子點濃度增加而增強;而對于CH3-PEG-QDs而言，當(dāng)濃度高達(dá)400 nM時細(xì)胞上才可觀察到熒光信號。

這三種量子點表面沒有細(xì)胞膜特異性的配體，因此圖2中細(xì)胞上的熒光信號是由量子點與細(xì)胞之間非特異性的靜電吸附所引起的。大多數(shù)細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，容易吸附表面帶正電荷的量子點(如NH2-PEG-QDs);另外，細(xì)胞膜表面還鑲嵌了各種膜蛋白，有些膜蛋白在生理條件下帶正電荷，會吸附表面帶負(fù)電荷的量子點(如COOH-PEG-QDs);相對而言，表面幾乎不帶電荷的量子點(如CH3-PEG-QDs)與細(xì)胞的非特異性吸附就顯得小些。

2.2.2 共孵育時間的影響

考察了NH2-PEG-QDs，COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞在37 ℃孵育不同時間的情況，結(jié)果如圖3所示。隨著孵育時間的增加，均可觀測到細(xì)胞上熒光信號強度的增強，說明細(xì)胞上非特異性吸附這三種量子點的量在增加。在相同的時間內(nèi)，NH2-PEG-QDs在COS-7細(xì)胞上的吸附最多，其次是COOH-PEG-QDs，CH3-PEG-QD的吸附最少。

2.2.3 血清的影響

考察了培養(yǎng)基中血清對不同功能化基團修飾的量子點與細(xì)胞作用的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，血清的存在可以明顯降低量子點在細(xì)胞上的吸附，這可能是由于血清中的某些成分與量子點發(fā)生非特異性吸附，從而改變量子點表面的電荷與大小，進而使得這些量子點難以吸附在細(xì)胞上。

2.2.4 孵育溫度的影響

考察了NH2-PEG-QDs，COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞在不同溫度下的孵育情況，結(jié)果如圖5所示。從圖可知，孵育溫度對NH2-PEG-QDs與細(xì)胞作用的影響非常明顯:隨著孵育溫度升高，圖5a中熒光強度明顯增加，說明細(xì)胞上量子點的數(shù)量明顯增加。孵育溫度對COOH-PEG-QDs與細(xì)胞作用的影響相對較小，而對CH3-PEG-QD幾乎沒有影響。

一般而言，細(xì)胞對與量子點的作用主要包括量子點在細(xì)胞膜表面的吸附和量子點的內(nèi)化兩個階段。當(dāng)細(xì)胞在4 ℃培育時，由于缺少能量，細(xì)胞的生命活動受到了的抑制，此時量子點與細(xì)胞作用主要是在細(xì)胞膜表面的吸附。在37 ℃培育時，量子點的吸附和內(nèi)化同時發(fā)生，所以在37 ℃培育溫度下，對NH2-PEG-QDs與COOH-PEG-QDs而言，與細(xì)胞結(jié)合的量子點的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在4 ℃條件下的結(jié)合量。而CH3-PEG-QD，由于表面ξ電位為- 1.2 ± 0.8 mV，既不易吸附在細(xì)胞表面，也不易通過內(nèi)化進入細(xì)胞，因此孵育溫度對其與細(xì)胞作用影響不大。

綜上所述，量子點與細(xì)胞的作用是一個依賴于量子點的濃度、表面電荷、培育時間與溫度，并受培養(yǎng)基中血清影響的耗能過程。該研究工作為進一步開展基于量子點的細(xì)胞成像研究與應(yīng)用提供參考。

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