梁雄燕，楊玉瑩，張 瑩，鐘 蓓 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

內(nèi)源性禽白血病病毒ev/J gp85基因的表達

梁雄燕，楊玉瑩，張 瑩，鐘 蓓 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

從已構(gòu)建的質(zhì)粒pGEM-MTCgp85中酶切回收ev/Jgp85基因，通過構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ev/Jgp85和重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ev/Jgp85，將ev/Jgp85基因轉(zhuǎn)入Bac-to-Bac高效真核表達系統(tǒng)的Sf9 昆蟲細胞進行真核表達。間接免疫熒光試驗顯示，構(gòu)建的重組桿狀病毒感染的Sf9細胞出現(xiàn)與野生型桿狀病毒感染的Sf9細胞陰性對照明顯不同的亮綠熒光；Western blot 分析DAB 顯色，重組病毒感染的Sf9細胞蛋白顯示出約35 ku的陽性條帶。結(jié)果表明，內(nèi)源性ev/Jgp85基因在Sf9細胞中得到良好的表達，并且其編碼產(chǎn)物完全可以被外源性ALV-J的特異性單抗JE9識別。

內(nèi)源性禽反轉(zhuǎn)錄病毒；ev/J；gp85基因；表達

ev/J(或稱為EAV-HP)是在深入研究J亞群禽白血病(ALV-J)的過程中發(fā)現(xiàn)的、存在于雞染色體中與ALV-J具有高度同源性的一類內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒。ev/J主要存在于原雞屬(Gallus)，盡管在原雞屬內(nèi)不同成員的染色體上表現(xiàn)了不同程度的pol基因的缺失，但基本上擁有與ALV-J相似的5-LTR-gag-pol-env-LTR-3’典型結(jié)構(gòu)[1]。ALV-J主要引起肉雞的髓細胞性白血病，病毒囊膜基因env是區(qū)別于其他亞群而成為一個新亞群的主要依據(jù)，由膜表面糖蛋白(SU)基因gp85和跨膜糖蛋白(TM)基因gp37組成[2]。同源性分析表明，J亞群ALV的env與其他外源性亞群A～D的env基因只有40%的同源性，而與內(nèi)源性病毒ev/J有97%的同源性[3,4]。這種高度同源性表明，ev/J內(nèi)源性類env基因可能通過基因重組參與了外源性ALV-J的形成。對J亞群分離毒株進行分析，各毒株env基因表現(xiàn)出的不同程度變異，主要集中在gp85基因。盡管亞群分類的標準之一是env的交叉中和反應(yīng)，然而變異的現(xiàn)象導(dǎo)致許多ALV-J毒株中和性抗血清不能相互中和[5]。

在ALV亞群中，gp85基因所編碼的SU蛋白至少涉及誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位、感染發(fā)生中病毒與細胞受體相互作用的病毒配體等生物學(xué)功能[6]，然而高度同源的內(nèi)源性序列究竟有何生物學(xué)功能還不得而知。因此，本研究在J亞群ALV-Jgp85基因研究的基礎(chǔ)上，對內(nèi)源性類J 亞群禽白血病病毒gp85基因進行了表達，以期進一步了解ev/J與外源性病毒及宿主間的復(fù)雜生物學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1. 1 材料與主要試劑

pGEM-MTCgp85質(zhì)粒為自制。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1、轉(zhuǎn)座宿主菌DH10Bac(含桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid和Helper輔助質(zhì)粒)購自Ivitrogen公司?？笰LV-J單抗JE9、大腸桿菌DH5α、Sf9細胞和野生型桿狀病毒由揚州大學(xué)微生物實驗室提供。Lipofectin轉(zhuǎn)染試劑為Gibco/BRL公司產(chǎn)品。T4連接酶為Promega公司產(chǎn)品。dNTP、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和DNA Marker為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。QIA quick瓊脂糖回收試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。胎牛血清購自Hyclone公司。FITC標記的羊抗鼠IgG，HRP標記的兔抗鼠的IgG，二氨基聯(lián)苯氨(DAB)均為Sigma公司產(chǎn)品。IPTG、X-gal、預(yù)染蛋白Marker、M13/pUC通用上、下游引物購自上海生物工程公司。

1.2 桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ev/J gp85的構(gòu)建與鑒定

取含質(zhì)粒pGEM-MTCgp85質(zhì)粒的DH5α接種于含Ampicillin(100 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，以限制性內(nèi)切酶BamH I/PstI雙酶切，用QIAGEN公司的QIAquick瓊脂糖核酸回收試劑盒純化目的條帶。

將回收純化的ev/Jgp85基因7 μL和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1 1 μL，10×Ligation Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，4 ℃下連接過夜制備重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ev/Jgp85，并轉(zhuǎn)化入用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α中進行LB平板藍白斑篩選，挑取白色菌落接種于含Ampicillin(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶BamH I和PstI進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定插入的目的片段。

1.3 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ev/J gp85的構(gòu)建及鑒定

用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，按Bac-to-Bac表達系統(tǒng)說明書將重組的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)入DH10Bac中，接種至KGTIX LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素、40 μg/mL IPTG和200 μL/mL X-gal)，篩選白色菌落。

主要步驟為：取100 μL DH10Bac感受態(tài)細胞，加入約10 ng的pFastBac1-ev/Jgp85重組質(zhì)粒，輕輕混勻后冰浴30 min，42 ℃熱休克45 s，迅速置冰水混合物中1～2 min，然后加入900 μL的SOC培養(yǎng)基，37 ℃ 225 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，然后用SOC培養(yǎng)基作10-1、10-2、10-33個稀釋度，每個稀釋度分別取200 μL涂布KGTIX LB平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，至菌落出現(xiàn)。

篩選的菌落重新接種KGTIX LB培養(yǎng)基純化2次，接種含50 μg/mL的卡那霉素、7 μg/mL的慶大霉素、10 μg/mL的四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 300 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按改良的堿裂解法提取重組穿梭載體Bacmid-ev/Jgp85 DNA。用M13/pUC通用上、下游引物對所提取的Bacmid-ev/Jgp85 DNA進行PCR鑒定(設(shè)不含ev/Jgp85基因的Bacmid DNA的陰性對照)。鑒定陽性的Bacmid-ev/Jgp85 DNA用于轉(zhuǎn)染Sf9細胞。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL、50 pmol上下游引物引物各1 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、Bacmid-ev/Jgp85 DNA模板1 μL、去離子水37.5 μL。循環(huán)條件為94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min ，共33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 重組桿狀病毒rBacmid-ev/J gp85的制備

將處于對數(shù)分裂期的Sf9細胞用Grace完全培養(yǎng)基輕輕吹下，稀釋至4.5×105個細胞/mL，按2 mL每個培養(yǎng)皿將細胞懸液加入直徑35 mm培養(yǎng)皿(密度約為50%)，貼附40 min。同時取2個滅菌指形管均加100 μL無任何添加物的pH6.2的Grace培養(yǎng)液命為A、B管，在A管加入5 μL Bacmid-ev/Jgp85 DNA混勻即為轉(zhuǎn)染A液，在B管加入6 μL的Lipofectin混勻即為轉(zhuǎn)染B液。將2管液體混勻室溫放置15 min，加入800 μL無任何添加物的Grace培養(yǎng)液中命為C液，吸去Sf9細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，將C液加入Sf9細胞表面，27 ℃孵育6 h。吸去轉(zhuǎn)染C液，加入2 mL含10% FCS的完全培養(yǎng)基，27 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至Sf9細胞出現(xiàn)明顯病變。通過收集病變明顯Sf9細胞上清即為P1代重組病毒命為rBacmid-ev/Jgp85。用P1代重組病毒接種對數(shù)生長期的Sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)5～7 d至細胞完全破碎時，收集培養(yǎng)上清命為P2代重組病毒，重復(fù)1次擴增P3代重組病毒用于重組蛋白表達的鑒定。不含ev/Jgp85基因的Bacmid DNA陰性對照以同樣的方法同時進行。

1.5 重組蛋白在Sf9細胞中的表達檢測

收獲P3代重組桿狀病毒感染72～96 h，出現(xiàn)明顯病變的Sf9細胞，以抗ALV-J的單克隆抗體JE9為一抗，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG為二抗進行間接免疫熒光反應(yīng)檢測，亮綠色熒光者為陽性。以抗ALV-J的單克隆抗體JE9為一抗，HRP標記兔抗鼠IgG為二抗進行重組蛋白Western-blotting 檢測，2種檢測均設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果與分析

1.10 kb DNA Marker；2. pGEM-MTCgp85酶切結(jié)果圖1 ev/J gp85的酶切回收 Figure 1 Recovey of ev/J gp85 by Enzyme digested of pGEM-MTCgp85

2.1 ev/J gp85酶切回收

用BamH I/PstI雙酶切pGEM-MTCgp85，1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示成功切出一條約940 bp的條帶，與ev/Jgp85預(yù)期大小相符(圖1)。

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ev/J gp85的酶切鑒定

pFast Bacl-ev/Jgp85轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過Amp抗性篩選陽性克隆，小量提取質(zhì)粒后，BamH I和PstI雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示ev/Jgp85基因片段插入到pFastBac1載體中。重組轉(zhuǎn)移載體pFast Bacl-ev/Jgp85的酶切圖譜如圖2所示。

2.3 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ev/J gp85構(gòu)建與鑒定

重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac1-ev/Jgp85轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細菌進行轉(zhuǎn)座反應(yīng)后，挑取白色菌落在KGTIX的平板上經(jīng)2次純化排除假陽性，進行質(zhì)粒的小提。對重組的Bacmid-ev/Jgp85進行了PCR鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見一條約1 000 bp的特異性片段(圖3)，與預(yù)計大小相符，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid陰性對照未能擴增出相應(yīng)的條帶，證明內(nèi)源性ev/Jgp85已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)座到Bacmid穿梭載體中。

1.10kbDNAMarker;2.BamHI和PstI雙酶切結(jié)果圖2 重組轉(zhuǎn)移載體酶pFastBac1-ev/Jgp85切鑒定Figure2 EnzymedigestionanalysisofrecombinantvectorpFastBac1-ev/Jgp851.10kbDNAMarker;2.rBacmid-ev/Jgp85PCR產(chǎn)物;3.Bacmid對照的擴增產(chǎn)物圖3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-ev/Jgp85PCR鑒定Figure3 EnzymedigestionanalysisofrecombinantshuttleplasmidBacmid-ev/Jgp85

2.4 重組病毒rBacmid-ev/J gp85的制備

將重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ev/Jgp85通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)72 h后，細胞開始出現(xiàn)病變，細胞核腫大，細胞內(nèi)有形態(tài)不規(guī)則的透明顆粒，并逐漸增大，96 h后細胞開始死亡，待細胞基本都崩解時收獲上清，離心過濾后即為P1代重組桿狀病毒。為了表達需要，將P1病毒在Sf9細胞上擴增出了高滴度的P2代重組病毒和P3代重組病毒。

2.5 表達物間接免疫熒光檢測

用丙酮∶乙醇(3∶2)固定重組桿狀病毒和野生桿狀病毒感染的Sf9細胞，以抗ALV-J單克隆抗體JE9作為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行熒光染色，結(jié)果感染重組桿狀病毒rBacmid-ev/Jgp85的Sf9細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)亮綠色熒光(圖4A)，而野生桿狀病毒感染的Sf9細胞的對照呈陰性反應(yīng)(圖4B)，說明內(nèi)源性ev/Jgp85基因在Sf9細胞中得到良好的表達。

A.重組桿狀病毒rBacmid-gp85-like感染Sf9細胞72 h后的間接免疫熒光檢測結(jié)果圖 B.野生桿狀病毒Bacmid陰性對照圖4 表達物間接免疫熒光檢測Figure 4 Indirect IFA staining of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus encoding ev/J gp85

2.6 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 及Western blot 分析結(jié)果

1.野生桿狀病毒DH10BAC 感染的Sf9 細胞;2.重組桿狀病毒rBacmid-ev/J gp85 感染的Sf9細胞;3.重組桿狀病毒rBacmid-env4817感染的Sf9細胞; 4.預(yù)染蛋白質(zhì)Marker圖5 ev/J gp85 基因表達產(chǎn)物的 Western blot 分析Figure 5 Western blot analysis of ev/J gp85 gene product expressed in Sf9 cells

分別收集重組桿狀病毒rBacmid-ev/Jgp85和野生桿狀病毒DH10BAC 感染96 h 后的Sf9 細胞，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，重組病毒和野生病毒感染的Sf9 細胞的蛋白質(zhì)條帶無明顯區(qū)別。但將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)Western blot 分析DAB 顯色，重組病毒感染的Sf9 細胞中出現(xiàn)一條約35 ku條帶，大小與非糖基化的ALV-Jgp85的分子量(36 ku)大小接近，而空Bacmid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的野生桿狀病毒感染的Sf9 細胞中未出現(xiàn)相應(yīng)的條帶(圖5)。這進一步證實了ev/Jgp85基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的得到了表達。

3 討論

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ev/J是在深入研究20世紀80年代后期新發(fā)現(xiàn)的引起雞髓細胞性白血病的J亞群禽白血病病毒(ALV-J)的過程中在雞的基因組中發(fā)現(xiàn)的[1]。在目前已知的所有脊椎動物的反轉(zhuǎn)錄病毒中，只有雞(準確地說是家雞，其祖先是紅原雞)的染色體基因上存在與ALV-J有如此高同源性的對應(yīng)內(nèi)源性病毒序列，其env基因同源性高達97%[ 3,4]。env基因高度的同源性預(yù)示著其編碼物可能潛在的具有與外源性病毒env基因編碼物具有類似的功能及活性。

關(guān)于內(nèi)源性ev/Jgp85基因編碼物的生物學(xué)活性，Caroline等[7]分別將ev/J4.1和ALV-J Hc1 的env克隆入MLV，構(gòu)建了偽型重組MLV，在DF1細胞上與HPRS-103 ALV-J一起進行了干擾試驗，結(jié)果表明ev/J4.1env完全可以與Hc1env和HPRS-103的感染相互干擾。說明它們擁有共同的感染通道和細胞受體。

為了解內(nèi)源性ev/J SU的生物學(xué)活性狀況，本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達系統(tǒng)表達了源自商品肉雞的ev/Jgp85基因。結(jié)果以抗ALV-J的單克隆抗體JE9為一抗的間接免疫熒光試驗，構(gòu)建的重組桿狀病毒感染的Sf9細胞顯示出與野生型桿狀病毒感染的Sf9細胞陰性對照明顯不同的亮綠熒光；經(jīng)Western blot分析顯示，重組病毒感染的Sf9細胞蛋白顯示出約35 ku的陽性條帶，大小與非糖基化的ALV-Jgp85的分子量(36 ku)大小接近。

試驗表明,內(nèi)源性ev/Jgp85基因在Sf9細胞中得到良好的表達，并且其編碼產(chǎn)物完全可以被外源性ALV-J的特異性單抗JE9識別，證實了內(nèi)源性ev/Jgp85基因重組表達物與外源性ALV-J囊膜糖蛋白之間具有生物學(xué)相關(guān)性，為進一步研究內(nèi)源性內(nèi)源性ev/J奠定了基礎(chǔ)。但本研究與楊玉瑩等[6]表達的外源性ALV-Jgp85 SU(54 ku)有一定的差異，這一差異的原因是否是由于糖基化不完全造成，還有待進一步研究。

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2008-09-12

國家自然科學(xué)基金資助(30460098)

梁雄燕 (1982-)，男，湖北襄樊人，碩士研究生，研究方向為動物病原微生物學(xué)與分子生物學(xué).

楊玉瑩，E-mail: yangyycn@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.016

Q786

A

1673-1409(2009)01-S054-05