龔道蘭，楊代勤，李 濤 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

尼爾雌醇對產(chǎn)后雌性黃鱔性腺轉(zhuǎn)化及發(fā)育的影響

龔道蘭，楊代勤，李 濤 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

在餌料中分別添加0、4、8、12、16 μg/g尼爾雌醇，對產(chǎn)后雌鱔(Monopterusalbus)進行為期8周的飼養(yǎng)試驗，以觀察黃鱔性腺轉(zhuǎn)化及發(fā)育狀況。結(jié)果表明：隨著尼爾雌醇投喂?jié)舛鹊脑黾?，黃鱔卵巢成熟系數(shù)逐步增大；對照組黃鱔的性腺表現(xiàn)為乳白色細(xì)索狀的精巢樣組織，而其他4個試驗組黃鱔均保持為卵巢外觀。其中，劑量為4 μg/g和8 μg/g時的試驗組黃鱔卵母細(xì)胞以Ⅲ～Ⅳ時相為主，劑量為12 μg/g和16 μg/g的則以Ⅴ時相為主，對照組性腺組織中以開始發(fā)育的精原細(xì)胞為主，及少量敗育的Ⅴ～Ⅳ時相卵母細(xì)胞，說明尼爾雌醇對黃鱔的產(chǎn)后卵巢存在不同程度的維持效應(yīng)，從而延緩性轉(zhuǎn)變時間。

黃鱔(Monopterusalbus)；性逆轉(zhuǎn)；尼爾雌醇

黃鱔(Monopterusalbus)亦稱鱔魚，是我國重要的淡水名優(yōu)魚類之一，由于生長快、成活率高以及對網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件的適應(yīng)性好、養(yǎng)殖經(jīng)濟效益高，是一種極具發(fā)展前景的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。但由于黃鱔懷卵量少，又存在性逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致了雌性黃鱔的個體小、個體繁殖力低、雌雄個體大小不協(xié)調(diào)等問題，極大地限制了黃鱔繁殖苗種的規(guī)模。

人工投喂或注射外源性性激素是控制魚類性別的有效途徑，國內(nèi)外應(yīng)用天然激素作為外源性激素控制魚類性轉(zhuǎn)化的研究已經(jīng)取得顯著成效[1～4]，而采用半合成雌激素誘導(dǎo)魚類雌性化的報道尚少。尼爾雌醇是一種主要作為補充雌激素替代治療，調(diào)整植物神經(jīng)系統(tǒng)，改善絕經(jīng)后引起的骨質(zhì)疏松，抗輻射以及改善內(nèi)外生殖器官的局部條件的半合成雌激素類藥[5]。相關(guān)研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前臨床用于雌激素缺乏引起的婦女絕經(jīng)期或更年期綜合征，而在動物應(yīng)用上報道較少，僅限于兔、鼠的研究性試驗，在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上尚未見報道。

本研究通過對產(chǎn)后雌鱔進行為期8周的外源性雌激素尼爾雌醇的投喂，探討了不同劑量的尼爾雌醇對產(chǎn)后雌鱔性別的維持效果與性腺的發(fā)育情況，以期能獲得大規(guī)格成熟度高的雌鱔親本用于其苗種生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試黃鱔來源于長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院黃鱔養(yǎng)殖基地催產(chǎn)繁殖后的個體，體長30～45 cm，體重50～140 g，健康雌鱔。尼爾雌醇為上海華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)，分析純，批號：6903741051017。

1.2 方法

將試驗黃鱔經(jīng)過10 d室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)魚系統(tǒng)暫養(yǎng)，適應(yīng)該養(yǎng)殖環(huán)境之后，選取體質(zhì)健康的黃鱔75尾，根據(jù)所投喂餌料中尼爾雌醇含量的不同而分為5組，其添加劑量分別為4、8、12、16、0 μg/g(對照組)，每組3個平行，共15個塑料水族箱飼養(yǎng)，每箱養(yǎng)魚5尾，初始體重組間無差異。

試驗于2007年8月10日至10月15日在長江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖基地室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)魚系統(tǒng)進行，該養(yǎng)魚系統(tǒng)采用塑料水族箱的規(guī)格為54 cm×42 cm×30 cm，養(yǎng)殖用水為經(jīng)充分曝氣的自來水，保持溶氧量gt;6.5 mg/L，氨氮量lt;0.102 5 mg/L，室溫由制冷空調(diào)穩(wěn)定在(25±1) ℃，水溫保持在25℃。每日18：00時定點投飼，按體重的5%投喂含尼爾雌醇的餌料，投喂的餌料為白鰱肉糜。

飼喂56 d后將黃鱔體表擦干，準(zhǔn)確稱量其體重，隨后解剖并分離性腺，外觀鑒別雌、雄并準(zhǔn)確稱取性腺重，固定于8%福爾馬林液。48 h后石蠟切片，H.E法染色，制成厚度為7 μm的性腺連續(xù)切片，光學(xué)顯微鏡觀察。

黃鱔性腺和生殖細(xì)胞的分期均參照周定剛等[6]和肖亞梅[7]的方法，根據(jù)生殖腺內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育狀況，將黃鱔雌性發(fā)育階段劃分為6個時相。

性腺成熟系數(shù)(GSI)(%)=性腺重/體重×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理和檢驗分析。成熟系數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)中的Duncan’s多重比較進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量尼爾雌醇對黃鱔性腺外觀形態(tài)的影響

采用不同劑量尼爾雌醇飼喂產(chǎn)后黃鱔56 d后，肉眼可見對照組黃鱔性腺呈線狀，為乳白色精巢組織(圖1e)，其他各試驗組黃鱔的性腺均為卵巢，肉眼可見處于不同發(fā)育階段的卵粒。投喂劑量為4 μg/g試驗組和其他3個試驗組相比，其黃鱔性腺外形規(guī)整，呈明顯清晰的黃色且質(zhì)地均勻而透明(圖1a)，而在投喂劑量為8 μg/g、12 μg/g和16 μg/g的3個試驗組中，黃鱔性腺雖然表現(xiàn)卵巢的外觀，但卵巢的外部形態(tài)變得不規(guī)則，從顏色看均表現(xiàn)出不同程度的退化狀態(tài)(圖1b～d)。

a：4 μg/g；b：8 μg/g；c：12 μg/g；d：16 μg/g；e：0 μg/g(對照組)。圖中箭頭所指為性腺。圖1 投喂不同劑量尼爾雌醇后黃鱔的性腺外觀Figure 1 The outer appearances of gonads in rice field eel after being fed with different levels of nilestriol

投喂劑量/(μg/g)0481216性腺成熟系數(shù)/%1.632.082.023.865.08

隨著投喂劑量的增加，8 μg/g、12 μg/g和16 μg/g的3個試驗組黃鱔性腺的成熟系數(shù)有逐步增大的趨勢，其性腺成熟系數(shù)分別為2.02%、3.86%和5.08%(表1)。而在4 μg/g和8 μg/g的2個試驗組中，其性腺成熟系數(shù)分別為2.08%和2.02%，差異不顯著(Pgt;0.05)?？傮w而言，各試驗組所對應(yīng)的性腺成熟系數(shù)均明顯大于對照組的1.63%，其中12 μg/g和16 μg/g試驗組的性腺成熟系數(shù)與對照組相比有顯著增大(Plt;0.05)。

2.2 尼爾雌醇對黃鱔卵巢發(fā)育的影響

采用不同添加劑量的尼爾雌醇投喂產(chǎn)后黃鱔后，4個試驗組黃鱔的組織切片均顯示黃鱔的性腺發(fā)育處于雌性發(fā)育階段。生殖腺囊中存在著大量的各時期的卵母細(xì)胞，同一生殖腺囊內(nèi)的生殖細(xì)胞發(fā)育呈明顯的不同步性。投喂劑量為4、8 μg/g時，黃鱔卵母細(xì)胞以Ⅲ～Ⅳ時相為主；而在投喂劑量為12、16 μg/g時，黃鱔卵母細(xì)胞則以Ⅴ時相為主。

(1)4 μg/g劑量組黃鱔的卵粒發(fā)育良好， 卵巢以Ⅲ～Ⅳ時相的卵母細(xì)胞為主。卵巢中卵母細(xì)胞形狀較為規(guī)則，呈多角形或圓形，有的存在細(xì)胞核，有的細(xì)胞核消失，但胞質(zhì)均勻且明顯可見卵粒中積累有較為致密的卵黃。部分卵母細(xì)胞的卵膜周圍存在空隙。卵母細(xì)胞排列較松散，有相當(dāng)數(shù)量的空濾泡存在(圖2A1～A4)。

(2)8 μg/g劑量組黃鱔的卵巢中以Ⅲ時相的卵母細(xì)胞為主。與4 μg/g的試驗組相比，其卵巢中卵母細(xì)胞排列緊密，卵母細(xì)胞胞質(zhì)部分雖可見卵黃積累但存在空的間隙，空濾泡相對較少，Ⅲ時相卵母細(xì)胞為主，有少量Ⅳ時相卵母細(xì)胞。因此，從組織學(xué)上看，與4 μg/g劑量組相比，該試驗組對于維持卵巢的功能和延緩黃鱔的性逆轉(zhuǎn)更為有效(圖2B1～B4)。

(3)12 μg/g劑量組黃鱔的卵巢以敗育的Ⅴ時相卵母細(xì)胞為主。卵巢中卵母細(xì)胞體積變大且排列十分緊密，胞質(zhì)疏松且出現(xiàn)數(shù)量多達幾十個的空泡，細(xì)胞核溶解，卵黃充滿整個卵母細(xì)胞，看不見細(xì)胞核，核質(zhì)溶解。該濃度下黃鱔卵巢的卵粒開始敗育，絕大多數(shù)卵細(xì)胞看不見細(xì)胞核，有細(xì)胞核的細(xì)胞其細(xì)胞核則偏移于一側(cè)(圖2C1～C4)。

(4)16 μg/g劑量組黃鱔的卵巢同樣以敗育的Ⅴ時相的卵母細(xì)胞為主。卵巢的組織結(jié)構(gòu)與12 μg/g的試驗組大體相似，但卵母細(xì)胞排列相對疏松，部分卵母細(xì)胞有細(xì)胞核，偶見空濾泡(圖2D1～D4)。

(5)對照組黃鱔卵的巢極度退化，其生殖腺大部分呈乳白色塊狀，精原細(xì)胞開始發(fā)育，并有少量敗育的Ⅴ～Ⅳ時相卵母細(xì)胞和產(chǎn)后的空濾泡腔分布于乳白色性腺塊中，卵母細(xì)胞發(fā)白、形態(tài)不規(guī)則且分布十分松散(圖2E1～E2)。

從以上結(jié)果可以看出，隨著尼爾雌醇使用劑量的增加，促進卵巢發(fā)育作用的效果越明顯，表明尼爾雌醇可延緩黃鱔的性逆轉(zhuǎn)。

3 討論

魚類屬低等脊椎動物，其中少數(shù)魚雌雄同體，分為同時性雌雄同體和相隨性雌雄同體2種類型[8]。劉建康[9]、Liem[10]﹑Chan[11，12]等國內(nèi)外學(xué)者研究表明，黃鱔為相隨性雌雄同體，且是雌性先熟型雌雄同體，即從胚胎到性成熟期都是雌性，雌性性成熟產(chǎn)卵后，卵細(xì)胞敗育，卵巢逐漸退化，同時，分布于生殖腺上的原始精原細(xì)胞開始生長發(fā)育，然后向雄性過渡，發(fā)生性變化后不再由雄性個體逆返為雌性個體[8]。

早在1962年，Reinboth[13]就推測激素可能在性逆轉(zhuǎn)中起重要作用。至今為止，盡管其作用機制尚不清楚，但激素參與性逆轉(zhuǎn)是無可非議的。用一定劑量的雌二醇喂養(yǎng)Clariaslazera一段時間，解剖后發(fā)現(xiàn)，大部分實驗魚的生殖腺是卵巢，只有小部分殘留于卵巢表面部分是精巢，其結(jié)果顯示，雌二醇已基本上將其由遺傳性雄性改變?yōu)楣δ苄源菩?。Tang[14]認(rèn)為，哺乳動物的促黃體生成激素能刺激黃鱔的性反轉(zhuǎn)，在所有處理魚中都能刺激間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，約有百分之七十的魚發(fā)育的精巢小葉顯示活躍的精子發(fā)生。而且不同激素對控制黃鱔性逆轉(zhuǎn)的有效作用時期不同。Yeung等[15]證實哺乳類的促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)能促進黃鱔性轉(zhuǎn)變，但是僅對產(chǎn)卵后的雌鱔有效，LH對產(chǎn)卵前期的雌鱔沒有誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)變的效果。石瓊等[16]發(fā)現(xiàn)，由此排卵時及排卵后,褪黑激素影響黃鱔性腺進一步發(fā)育的作用不大。推測褪黑激素對性腺發(fā)育產(chǎn)生顯著影響的關(guān)鍵時間可能是在靜止期,亦即Ⅳ期或/和Ⅳ期之前。趙云芳等[17]用合成雌激素乙烯雌酚注射未產(chǎn)卵的12尾黃鱔，經(jīng)過一年飼養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)黃鱔性腺全表現(xiàn)為Ⅲ～Ⅳ期卵巢，雌性保持率和懷卵量均明顯大于對照組。該試驗結(jié)果也表明雌性激素可延緩黃鱔的性逆轉(zhuǎn)，即雌性激素對黃鱔卵巢具有維持效應(yīng)。本試驗中的4個試驗組，性腺均表現(xiàn)為以卵母細(xì)胞為主，而對照組的性腺已經(jīng)表現(xiàn)為精巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，再次驗證雌性激素對黃鱔卵巢的維持作用。

A1～A4：4 μg/g；B1～B4: 8 μg/g； C1～C4:12 μg/g； D1～D4: 16 μg/g；E1～E2: 0 μg/g(對照組) NO:有核卵母細(xì)胞;DF:退化卵泡;KO:胞核溶解的卵母細(xì)胞;TT:精巢組織圖2 投喂不同劑量尼爾雌醇后黃鱔卵巢的組織切片圖Figure 2 Histological micrographs of rice field eels’ ovarian sections after being fed with different levels of nilestriol addition

在魚類的成功性轉(zhuǎn)換試驗中,外源激素的投喂劑量都存在一定范圍。國內(nèi)外資料[11，17]指出，甲基睪丸酮的投喂量有一適宜的劑量范圍,劑量過大會使生殖腺萎縮。本試驗的4個試驗組中，投喂劑量為4 μg/g、8 μg/g時，黃鱔性腺的成熟系數(shù)在2.0%左右，投喂劑量為12 μg/g、16 μg/g的黃鱔性腺的成熟系數(shù)則在3.5%～5.5%之間，均大于對照組的1.63%。周定剛等[6]的研究表明，黃鱔在5 月下旬至7 月下旬(繁殖季節(jié))，由于卵母細(xì)胞積累大量卵黃，其體積成倍增加，性腺成熟系數(shù)達到5.87%～15.91%的高峰值。由于本試驗在8～10月份進行，因此性腺的成熟系數(shù)與繁殖季節(jié)相比，均明顯下降。由此看來，投喂大劑量的雌激素可能對產(chǎn)后黃鱔卵巢的發(fā)育更具有激發(fā)和維持效應(yīng)。

與此同時，考慮到試驗魚取樣時間為10月份，這個時候出現(xiàn)Ⅲ時相以后的卵細(xì)胞到繁殖季節(jié)細(xì)胞敗育的可能性比較大，故認(rèn)為生殖腺中以不出現(xiàn)Ⅲ時相以后的卵母細(xì)胞為好。所以在生產(chǎn)中如果用尼爾雌醇來延緩雌鱔性逆轉(zhuǎn)，餌料中的適宜尼爾雌醇藥物濃度可能為8 μg/g。但不同劑量的尼爾雌醇等半合成雌激素藥物對產(chǎn)后黃鱔卵巢功能的長期維持效應(yīng)(如一個繁殖周期)，還有待于進一步研究。

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2008-09-18

國家“十一五”支撐計劃項目(2007BAD37B04)；湖北省“十一五”科技攻關(guān)項目(2006AA203A02)

龔道蘭(1984-)，女，湖北公安人，碩士研究生，研究方向為名特水產(chǎn)養(yǎng)殖.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.015

Q175;Q959.482

A

1673-1409(2009)01-S048-06