韓梅紅 (長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

谷長勤 (華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070)

2株鴨源腸球菌對小白鼠的致病性

韓梅紅 (長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

谷長勤 (華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070)

以臨床分離得到的2株鴨(Anasdomestica)源腸球菌(Enterococcas)分別接種小白鼠，觀察感染后小白鼠的主要臨床癥狀和病變特點，測定感染小白鼠的發(fā)病率、死亡率及半數(shù)致死量，并制作切片，光鏡下觀察各組織病變，以探討這2個菌株對小白鼠的致病性。結(jié)果表明，2株腸球菌均能造成小白鼠發(fā)病，其中北京株致病性較強。該病原主要侵害小白鼠肝臟、脾臟和腎臟，最明顯的病變特征為脾腫大、淤血，鏡下見脾臟淋巴細胞明顯減少、脾巨細胞增多、脾小體萎縮等；肝臟淤血、出血，甚至壞死，鏡下見肝竇狀隙擴張，聚集有細菌團塊或淋巴細胞，竇上皮細胞腫脹；腎間質(zhì)血管淤血，腎小管上皮細胞變性、壞死以及腎小管的蛋白管型等。揭示腸球菌可引起小鼠感染發(fā)病并導(dǎo)致組織病變而死亡。

腸球菌(Enterococcas)；鴨(Anasdomestica)；小白鼠；致病性

家禽的急性腸球菌(原屬于鏈球菌屬D群)感染最初見于1902年Moore等報道的雞類中風樣敗血癥，1932年Vaillancourt等首次報道火雞的鏈球菌病，1927年Katanbaf 等首次報告與鏈球菌有關(guān)的細菌性或贅生性心內(nèi)膜炎[1]。

禽類鏈球菌感染雖不常見，但卻呈世界范圍分布[2,3]。該病引起的急、慢性感染造成的損失可達50%。該病急性感染時，主要造成全身敗血性變化，并以發(fā)病快、死亡率高為特點[2,3]。目前國內(nèi)外尚未見腸球菌感染小白鼠的病理學研究的詳細報道。本研究初步探討了腸球菌(Enterococcas)對小白鼠的致病性和病變特點，以期為全面認識鴨(Anasdomestica)源鏈球菌的致病機理提供可借鑒的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為鴨源腸球菌臨床分離株鄭3株和北京株，由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供，分離于自然感染發(fā)病瀕死期和已死亡鴨的肝臟、心腔血和腦組織液。供試小白鼠為體重16～18 g的清潔級昆明系小白鼠(雌雄各半)共110只，購自湖北省預(yù)防醫(yī)學科學院實驗動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 試驗方法

(1)菌液的制備 利用平板菌落計數(shù)法將供試菌株進行活菌計數(shù)，并分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5cfu/mL 5個稀釋度的菌懸液。

(2)感染小白鼠發(fā)病、死亡規(guī)律及LD50測定 先通過預(yù)試測出最小致死劑量和最大存活劑量，在此基礎(chǔ)上進行正式試驗。將110只小白鼠隨機等分成11個組，第1～5組小白鼠分別經(jīng)腹腔注射鄭3株10-1、10-2、10-3、10-4、10-5cfu/mL 5個稀釋度的菌懸液0.2 mL/只，第6～10組小白鼠分別經(jīng)腹腔注射北京株10-1、10-2、10-3、10-4、10-5cfu/mL 5個稀釋度的菌懸液0.2 mL/只，第11組小白鼠腹腔注射無菌PBS 0.2 mL/只作對照。

接種后觀察其發(fā)病、死亡情況，包括小白鼠精神、食欲、被毛光澤度、體格狀況、警覺性以及躲避捕捉的能力等，每天觀察3～4次，連續(xù)觀察14 d，做好記錄。

采用簡化寇氏法按下式分別計算各菌株對小白鼠的半數(shù)致死量。

lgLD50=Xm-d(∑P-0.5)

式中，Xm為最大劑量的對數(shù)；d為組距；∑P為各組死亡率之和。

(3)細菌學檢查及病理學觀察 對死亡小白鼠及時尸檢，無菌條件下取肝臟、心血等病料進行細菌學檢查；觀察心、肝、脾、肺、腎、十二直腸、胰臟、腦等組織器官的大體病變，并取病變組織于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，H·E染色，光鏡下觀察各組織病變。未死亡的小白鼠于接種后14 d用斷椎法處死，同上進行細菌學檢查及病理學觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染小白鼠發(fā)病、死亡情況及半數(shù)致死量

在接種不同菌株不同劑量的菌液后，接種鄭3株的試驗小白鼠最早于感染后24 h開始出現(xiàn)臨床癥狀，之后高劑量組小白鼠開始出現(xiàn)死亡，4 d后半數(shù)以上小白鼠表現(xiàn)臨床癥狀，死亡高峰集中在5～7 d，9 d后停止死亡。各劑量組小白鼠共死亡24只，總死亡率為48%，LD50為1015.71。

接種北京株的試驗小白鼠最早于感染后24 h即表現(xiàn)臨床癥狀，并且10-1cfu/mL劑量組小白鼠最先開始死亡，3 d內(nèi)半數(shù)以上小白鼠表現(xiàn)臨床癥狀，死亡高峰集中于4～6 d，8 d后停止死亡，各劑量組小白鼠共死亡26只，總死亡率為52%，LD50為1013.61。

表1 小白鼠死亡情況及半數(shù)致死量(n=10)Table 1 Deaths and LD50 of laboratory mice(n=10)

對照組小白鼠接種后僅出現(xiàn)一過性精神沉郁癥狀，隨后即恢復(fù)試驗前狀態(tài)，接種后14 d內(nèi)無死亡情況，死亡率為0。各組小白鼠死亡情況及半數(shù)致死量測定結(jié)果詳見表1。

以上結(jié)果顯示，小白鼠在接種不同劑量2菌株后24～48 h陸續(xù)發(fā)病死亡，死亡高峰集中在4～7 d。但北京株對小白鼠的LD50較鄭3株低。

2.2 感染小白鼠臨床癥狀與病理學變化

接種不同劑量2菌株后各組小白鼠均明顯可見精神萎靡不振，閉目縮頸、背毛逆立、腹部抖動。隨著病程的延長可見病鼠消瘦，死亡與存活小白鼠肝臟中都可分離到較純的原接種菌。對照組小白鼠未見異常，剖檢無明顯病變，從心血、肝臟中亦未分離到細菌。

各組小白鼠腹腔注射不同株的菌液后均導(dǎo)致心、肝、脾、肺、腎、腸等器官不同程度的損傷。眼觀主要表現(xiàn)為心、肝、脾腫大，尤以脾腫大最為嚴重；肝、脾等臟器表面附著有大量纖維素性滲出物，心、肝、脾、肺、胃、十二指腸、腦等組織器官均見有不同程度的淤血、出血和壞死。另外，多數(shù)感染小白鼠肝臟呈灰白色或暗紅色壞死灶，少數(shù)見胸腔積液。

其組織病理學變化表現(xiàn)為：

接種鄭3株的小白鼠表現(xiàn)為局部出血、淤血，聚集有細菌團塊；接種北京株的小白鼠表現(xiàn)為淤血，肝竇內(nèi)皮細胞腫脹，散在分布有多核巨細胞，中央靜脈擴張，聚集成團分布的淋巴細胞，有的肝細胞壞死，細胞核濃縮。

從脾臟來看，接種鄭3株的小白鼠表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)疏松，脾小體體積縮小、數(shù)量變少，淋巴細胞減少，脾巨細胞大量增多；接種北京株的小白鼠表現(xiàn)為脾竇和脾靜脈淤血，白髓體積增大，淋巴細胞減少，脾巨細胞增多。

從肺臟來看，接種2菌株的小白鼠均見肺泡腔內(nèi)有少量水腫液，接種北京株的小白鼠肺泡壁毛細血管充血，肺泡腔內(nèi)有紅細胞聚集。

從腎臟來看，接種2菌株的小白鼠均見腎間質(zhì)輕微淤血，腎小管上皮細胞變性壞死、細胞核固縮，接種北京株的多數(shù)小白鼠腎小管腔或小動脈血管內(nèi)有粉染物質(zhì)。

從胃和十二指腸來看，接種2菌株后有的小白鼠胃和十二指腸輕微出血、炎性細胞浸潤；

從心臟來看，接種2菌株后的小白鼠病變都不十分顯著，僅見接種北京株的小白鼠心肌輕微出血，少數(shù)見心肌細胞壞死。

從腦來看，接種2菌株后的小白鼠均見腦膜輕微充血、出血。

以上結(jié)果顯示，接種2菌株后各組小白鼠組織病理學變化主要集中在肝臟和脾臟，表現(xiàn)為肝臟淤血、出血，淋巴細胞聚集；脾臟淤血，脾小體萎縮，白髓內(nèi)淋巴細胞減少等。比較發(fā)現(xiàn)，接種北京株的小白鼠病變較接種鄭3株的嚴重。

3 討論

腸球菌病是一種主要侵害機體實質(zhì)器官的急性敗血性疾病[4]。本研究結(jié)果揭示，該病的發(fā)病機理可能是病原菌侵入機體后，在感染局部引起炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為炎性腫脹和纖維素性炎性滲出；此時機體可能調(diào)動起全身的免疫器官，用以抵制病原菌的侵害作用，病理表現(xiàn)為脾臟的多核巨細胞和網(wǎng)狀細胞大量增生；在機體損傷與抗損傷的斗爭過程中，免疫器官可能也遭到損傷，病理表現(xiàn)為脾臟淋巴細胞的減少；此時病原菌乘虛而入，從感染灶不斷侵入血液，經(jīng)血液擴散全身，從而引起全身性敗血癥變化，最后機體常因多器官功能衰竭而死亡。

本研究中不同菌株對雛鴨的發(fā)病率、死亡率和各組織樣品的細菌分離率是判斷致病力強弱的重要指標。Vanrobaeys等[5]認為，鏈球菌發(fā)病率低于15%者視為低致病力菌株，高于65%者視為高致病力菌株，15%～65%者視為中等致病力菌株。本研究中，2株腸球菌對小白鼠均有致病性，且北京株毒力較強。

從感染小白鼠的病理變化來看，該病原主要侵害小白鼠肝臟、脾臟和腎臟，最明顯的病變特征為脾腫大、淤血，鏡下見脾臟淋巴細胞明顯減少，脾巨細胞增多，局部有細菌堆積，脾小體萎縮等；肝臟淤血、出血、甚至壞死，鏡下見肝竇狀隙擴張，聚集有細菌團塊或淋巴細胞，竇上皮細胞腫脹；腎間質(zhì)血管淤血，腎小管上皮細胞變性、壞死以及腎小管的蛋白管型等。綜合以上分析，2個菌株均能引起小鼠感染發(fā)病并導(dǎo)致組織病變而死亡。

[1]Saif Y M(蘇敬良,高 福,索 勛，譯).禽病學(第11版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.917～926.

[2]卡爾尼克B W (高 福，蘇敬良，譯)．禽病學[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1999.377～383.

[3]楊勁松，包幼迪．腸球菌致病性初探[J]．中國人獸共患病雜志， 1997，13(6)：33～35.

[4]李光輝．腸球菌感染研究進展[J]．國外醫(yī)學內(nèi)科學分冊，1999，26(11)：471～474.

[5]Vanrobaeys M,De Herdt P,Ducatelle R,etal. Extracellular proteins and virulence instreptococcusbovisisolates from pigeons[J].Vet Microbiol,1997,59: 59～66.

2008-06-30

韓梅紅(1979-)，女，河南汝州人，農(nóng)學碩士，助教，主要從事免疫病理學研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.010

S852.61+1

A

1673-1409(2009)01-S030-03