陸穎影 靖大道 王興鵬 吳愷

·論著·

埃羅替尼對胰腺癌細(xì)胞BxPC3生長的影響及其機(jī)制

陸穎影 靖大道 王興鵬 吳愷

目的觀察表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑埃羅替尼對體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞BxPC3生長的影響，并探討其作用機(jī)制。方法應(yīng)用MTT法檢測埃羅替尼作用后BxPC3細(xì)胞的增殖情況；用流式細(xì)胞分析、透射電鏡和原位末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化；RT-PCR法檢測細(xì)胞bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA表達(dá)。結(jié)果埃羅替尼呈劑量和時(shí)間依賴性抑制BxPC3細(xì)胞生長。72 h后，1、100 μmol/L的埃羅替尼處理組細(xì)胞存活率分別為(90.25±2.62)%和(40.75±2.98)%，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。50 μmol/L埃羅替尼處理BxPC3后24、96 h的細(xì)胞存活率分別為(74.0±4.08)%和(49.50±1.29)%，兩者比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。50 μmol/L埃羅替尼處理組的細(xì)胞凋亡率為(11.0±1.1)%，顯著高于對照組的(6.2±1.1)%(Plt;0.01)；G0/G1細(xì)胞占(73.4±1.3)%，也顯著高于對照組的(63.3±1.0)%；透射電鏡可見細(xì)胞呈現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)，并見凋亡小體形成。埃羅替尼處理組細(xì)胞bcl-2、bcl-xl mRNA表達(dá)下調(diào)，bax mRNA表達(dá)輕微上調(diào)，bak mRNA的表達(dá)不受影響。結(jié)論EGFR抑制劑埃羅替尼體外可抑制胰腺癌細(xì)胞系BxPC3的生長，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期，上調(diào)促凋亡蛋白和下調(diào)凋亡抑制蛋白有關(guān)。

胰腺腫瘤； 受體，表皮生長因子； 細(xì)胞凋亡； 埃羅替尼

表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜糖蛋白，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及細(xì)胞的生長、分化、增殖及代謝調(diào)節(jié)等多個(gè)方面。胰腺癌的EGFR表達(dá)明顯高于正常胰腺組織，并與胰腺癌的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[1-2]。

埃羅替尼(erlotinib)是一類EGFR酪氨酸激酶小分子抑制劑，已批準(zhǔn)作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的二線臨床治療藥物。其對胰腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，但作用機(jī)制尚不明確。本文觀察埃羅替尼對人胰腺癌細(xì)胞BxPC3增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、細(xì)胞生長抑制檢測

采用MTT法。人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。取對數(shù)生長期BxPC3細(xì)胞，以每孔5×1030個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入DMSO溶解的1、5、10、50、100 μmol/L的埃羅替尼(南京德寶生化器材有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入MTT 100 μg，繼續(xù)孵育4 h，加入150 μl DMSO，振蕩混勻后以酶標(biāo)儀測定A490值。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白對照和不予藥物干預(yù)的對照組。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A490-空白對照A490)/(對照組A490-空白對照A490)×100%。

二、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測

采用流式細(xì)胞儀分析。取對數(shù)生長期BxPC3細(xì)胞以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別加0、50、100 μmol/L埃羅替尼繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，制成1×106/ml的單細(xì)胞懸液，與含1%RNA酶的Tris-HCL緩沖液共同孵育10 min，碘化丙啶(PI)染色，200目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。

另取對數(shù)生長期BxPC3細(xì)胞接種于含玻片的12孔培養(yǎng)板，設(shè)0、50、100 μmol/L埃羅替尼3組培養(yǎng)48 h， PBS輕洗后多聚甲醛固定，按TUNEL試劑盒說明書操作。高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中所含的凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

三、細(xì)胞的凋亡形態(tài)觀察

收集上述培養(yǎng)48 h的3組細(xì)胞，固定、脫水、包埋、切片、染色后透射電鏡(CM120，Philips)觀察。

四、bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA的表達(dá)檢測

應(yīng)用5、50、100、200 μmol/L埃羅替尼處理 BxPC3細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，以Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，行RT-PCR。bcl-2上游5′-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3′，下游5′-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3′，產(chǎn)物458 bp；bax上游5′-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3′，下游5′-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3′，產(chǎn)物289 bp；bcl-xl上游5′-TTGGACAATGGACTGGTTG-3′，下游5′-GTAGAGTGGATGGTCAGTG-3′，產(chǎn)物765 bp；bak上游5′-TGAAAAATGGCTTCGGGGCAAGGC-3′，下游5′-TCATGATTTGAAGAATCTTCGTACC-3′，產(chǎn)物642 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3′，下游5′-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3′，產(chǎn)物408 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min， 94℃ 1 min、54℃ 1 min(GAPDH為 56 ℃)、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，GeneGenius凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、BxPC3細(xì)胞增殖的變化

作用72 h后，1、5、10、50、100 μmol/L埃羅替尼組細(xì)胞存活率分別為(90.25±2.62)%、(75.0±7.11)%、(69.75±5.97)%、(53.5±3.87)%和(40.75±2.98)%，100 μmol/L與1 μmol/L組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。50 μmol/L埃羅替尼處理BxPC3后24、48、72、96 h的細(xì)胞存活率分別為(74.0±4.08)%、(78.25±8.53)%、(51.12±1.31)%、(49.50±1.29)%，72、96 h組較24、48 h組抑制作用顯著增加(Plt;0.01)。

二、BxPC3細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化

應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析法，0、50、100 μmol/L埃羅替尼組細(xì)胞凋亡率分別為(6.2±1.1)%、(11.0±1.1)%、(13.2±2.0)%；TUNEL法分別為(3.6±0.5)%、(14.9±1.2)%、(16.5±1.0)%，藥物處理后細(xì)胞凋亡顯著增加(Plt;0.01)，但兩濃度組之間無顯著差異(Pgt;0.05)。相差顯微鏡下可見用藥組細(xì)胞有核固縮、核碎裂改變。

0、50、100 μmol/L埃羅替尼組G0/G1期細(xì)胞分別為(63.3±1.0)%、(73.4±1.3)%、(75.2±1.5)%，藥物處理使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(Plt;0.01)，但兩藥物組間無顯著差異。

三、BxPC3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

50 μmol/L 埃羅替尼處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞明顯縮小。胞膜光滑完整，部分細(xì)胞可見泡狀突起；細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂、腫脹；胞質(zhì)密度增加、濃染，出現(xiàn)大量空泡；核膜尚完整，但核內(nèi)容物密集皺縮，染色質(zhì)凝聚成塊并邊聚，形成一個(gè)或多個(gè)月牙小體(圖1)。

圖1對照組(A)、50 μmol/L 埃羅替尼組(B、C)細(xì)胞的透射電鏡觀察(×8000)

四、BxPC3細(xì)胞bcl-2、bax、bcl-xl、bak mRNA表達(dá)的變化

埃羅替尼可明顯抑制BxPC3細(xì)胞bcl-2、bcl-xl mRNA 的表達(dá)(Plt;0.01)，輕微上調(diào)bax mRNA的表達(dá)(Plt;0.05)，但不影響bak mRNA的表達(dá)(圖2)。

討 論

EGFR及其下游的信號分子(Ras-Raf-MEK-ERK軸)與胰腺癌的關(guān)系日益受到重視。針對EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)設(shè)計(jì)和合成特異性的EGFR抑制物，可望對胰腺癌的防治開辟新的途徑。埃羅替尼屬于喹唑啉類選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，在臨床前期和Ⅰ、Ⅱ期的試驗(yàn)中被證明對胰腺癌有效[3]，埃羅替尼聯(lián)合化療治療胰腺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究也在進(jìn)行之中[4]。雖然埃羅替尼體外對不同的胰腺癌細(xì)胞系均有明顯的抑制作用[5]，但對其作用機(jī)制所知較少。

M：marker、1～5分別為200、100、50、5、0 μmol/L埃羅替尼組

本研究結(jié)果顯示，埃羅替尼對體外培養(yǎng)的BxPC3細(xì)胞生長表現(xiàn)出抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性。埃羅替尼對BxPC3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為50 μmol/L，與Durkin等[5]的結(jié)果一致。

既往研究揭示，EGFR酪氨酸激酶抑制劑有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而起到放化療增敏的作用[6]。本結(jié)果顯示，埃羅替尼處理胰腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比例明顯增加，凋亡指數(shù)(AI)明顯升高。電鏡下可觀察到腫瘤細(xì)胞明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，提示埃羅替尼是通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖的。此外，埃羅替尼可以使胰腺癌細(xì)胞生長停滯在G0/G1期，減少有絲分裂細(xì)胞數(shù)量，提示細(xì)胞周期的阻滯也是埃羅替尼抗腫瘤生長的機(jī)制之一。

bcl家族在細(xì)胞凋亡中起重要作用，bcl-2和bcl-xl為抗凋亡基因，bax和bak為促凋亡基因。本研究結(jié)果顯示，埃羅替尼處理后，BxPC3細(xì)胞顯著下調(diào)bcl-2 mRNA和bcl-xl mRNA的表達(dá),輕微上調(diào)bax mRNA的表達(dá)，表明埃羅替尼通過上調(diào)促凋亡基因和下調(diào)凋亡抑制基因而增加細(xì)胞對凋亡的敏感性。

[1] Ueda S,Ogata S,Tsuda H,et al. The correlation between cytoplasmic overexpression of epidermal growth factor receptor and tumor aggressiveness:poor prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma.Pancreas,2004,29:e1-e8.

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2009-02-24)

(本文編輯：呂芳萍)

InvitroeffectoferlotinibonthegrowthofpancreaticcancercelllineBxPC3anditsmechanism

LUYing-ying,JINGDa-dao,WANGXing-peng,WUKai.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

JINGDa-dao,Email:jingdadao@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanism of erlotinib, an epidermal growth factor receptor inhibitor, on human pancreatic cancer cell lines BxPC3 in vitro.MethodsMethylthiazolyltetrazolium (MTT) assay was used to detected the proliferation of BxPC3 after exposure to erlotinib, apoptosis and cell cycle changes were studied by flow cytometry and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling assay (TUNEL). The expressions of bcl-2 mRNA, bax mRNA, bcl-xL mRNA and bak mRNA were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsErlotinib inhibited BxPC3 cells growth in a dose and time dependent manner in vitro. The cell viabilities in erlotinib 1μmol/L and 100 μmol/L groups 72 h later were (90.25±2.62)% and (40.75±2.98)%, and the difference was statistically significant (Plt;0.01). The cell viability in erlotinib 50 μmol/L groups 24 h and 96 h after BxPC3 exposure were (74.0±4.08)% and (49.50±1.29)%, and the difference was statistically significant (Plt;0.01). Cell apoptosis rate in erlotinib 50 μmol/L group was(11.0±1.1)%, which was significantly higher than (6.2±1.1)% in control group (Plt;0.01). G0/G1cell accounted for (73.4±1.3)% of all the cells, which was significantly higher than (63.3±1.0)% in control group. With transmission electron microscope, the morphology of BxPC3 cells showed typical apoptosis and apoptotic body. The expressions of bcl-2 mRNA, bcl-xl mRNA were down-regulated, while the expression of bax mRNA was slightly up-regulated, and the expression of bak mRNA was not affected.ConclusionsThe growth of BxPC3

cells could be suppressed by erlotinib and possible mechanisms involved blocking cell cycle, up-regulating apoptosis proteins and down-regulating apoptosis inhibitor proteins.

Pancreatic neoplasms; Receptor, epidermal growth factor; Apoptosis; Erlotinib

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.010

200080 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

靖大道，Email：jingdadao@medmail.com.cn