劉彥斌　米振國　楊新晶　任連生

[摘要]目的：觀察聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布與卡介苗治療大鼠膀胱腫瘤的療效，并探討其機(jī)制。方法：選用5～6周齡雌性Wistar大白鼠40只，隨機(jī)分為4組，即PBS組、塞來昔布組、卡介苗組、塞來昔布+卡介苗組。均采用膀胱灌注MNU(N-甲基亞硝基脲)制成大鼠膀胱腫瘤模型，于灌注MNU后第10周開始給予相應(yīng)的藥物干預(yù)治療，于第13周處死所有大鼠，觀察膀胱腫瘤的形成情況，免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的浸潤情況，TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)（apoptotic index,AI）。結(jié)果：聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤百分比及腫瘤細(xì)胞AI值與其他組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布和卡介苗比單純使用卡介苗或塞來昔布能更加明顯地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)免疫系統(tǒng)的功能和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增加而發(fā)揮作用的。

[關(guān)鍵詞] 膀胱腫瘤；塞來昔布；卡介苗

[中圖分類號] R737.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1674-4721（2009）05（a）-０25－０3

Effect of BCG combined with celecoxib on the animal model of bladder tumor

LIU Yanbin1,MI Zhenguo2*,YANG Xinjing1,REN Liansheng2

（1.The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China；2.Shanxi Tumor Hospital,Taiyuan 030013,China）

[Abstract] Objective: To observe the effect ofCelecoxib combined with BCG on the Wistar rats model of bladder tumor and discuss the mechanism of the therapeusis. Methods: Separated forty female 5-6 week-old Wistar rats into four groups: PBS groups, Celecoxib groups, BCG groups, Celecoxib+ BCG groups randomly. All the rats were irrigated MNU(M-methyl-N-nitrosourea) into their bladders to make of the bladder tumor models. Treatment took place on tenth week after irrigated MNU, four groups were irrigated corresponding drug into bladders; at thirteen week executed all rats, observed the development of bladder tumor, detected infiltrating condition of CD3+, CD4+, CD8+ cells in tumor tissues with immunohistochemistry, detected apoptosis condition of tumor cells with the method of TUNEL. Results: Celecoxib+ BCG groups compared with the other groups，the difference of the infiltration percentage of CD3+, CD4+, CD8+ cell and the degree of tumor cell apoptosis has statistical significance（P<0.05）. Conclusion: Combined Celecoxib and BCG can be more conspicuous inhibition of tumor growth of rat bladder than the use of celecoxib or BCG alone, The mechanism is maybe that promoting the function of immune system and increasing tumor cells apoptosis.

[Key words] Bladder tumor; Celecoxib; BCG

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，90%以上為移行上皮細(xì)胞癌，大部分為淺表性膀胱癌,除了用手術(shù)治療以外，還須輔以抗腫瘤藥物膀胱內(nèi)灌注治療，但有一定的復(fù)發(fā)率和應(yīng)用藥物的副作用，其中卡介苗是主要的治療藥物。本研究采用MNU膀胱灌注誘導(dǎo)建立大鼠膀胱腫瘤模型，用塞來昔布和卡介苗單獨(dú)和聯(lián)合用藥，評價其療效，以尋求更安全有效的膀胱腫瘤藥物聯(lián)合治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑

5～6周齡Wistar雌性大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；MNU由美國Sigma公司生產(chǎn)；凍干卡介苗購自上海生物制品研究所；塞來昔布由美國輝瑞公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑的配制

MNU溶液：用pH 6.0的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液為溶劑，將MUN配成濃度為20 mg/ml的溶液，每只大鼠用量0.1 ml。BCG溶液：50 mg/支凍干卡介苗溶于5 ml生理鹽水中，每只大鼠用量0.1 ml。塞來昔布:每只大鼠用量100 mg/kg，按大鼠體重確定其用量，溶于2 ml生理鹽水中。

1.2 方法

1.2.1 膀胱腫瘤大鼠模型的制備

40只大鼠造模過程：灌注前腹腔內(nèi)注射0.6%的戊巴比妥鈉麻醉動物，劑量為2.5 ml/kg。起效后仰臥固定，0.1%的碘伏消毒尿道外口后，用5 cm硬膜外導(dǎo)管導(dǎo)尿排空膀胱后，接上帶有6號半針頭的1 ml注射器按計(jì)劃向膀胱內(nèi)注入0.1 ml MNU溶液，每2周1次，共5次。

1.2.2 分組及處理

于第10周，將40只大鼠隨機(jī)分為4組：PBS組，塞來昔布組、卡介苗組、塞來昔布+卡介苗組，每組10只。開始給予藥物干預(yù)治療，分別給予0.1 ml PBS、100 mg/kg塞來昔布、0.1 ml 卡介苗、100 mg/kg塞來昔布+0.1 ml卡介苗，PBS 與卡介苗采用膀胱灌注給藥，每周1次，共3次，塞來昔布采用灌胃給藥，每天1次，共3周。

1.2.3 標(biāo)本處理

1.2.3.1 病理切片觀察：于第13周采用斷頸法處死大鼠，解剖膀胱，完整切取膀胱，于膀胱前壁剖開，觀察膀胱內(nèi)表面及腫瘤形成的大體情況；在病變明顯處切取部分腫瘤組織，置于中性福爾馬林溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 免疫狀態(tài)檢測：用免疫組化法分別檢測切片中腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+的表達(dá)量；TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞的AI值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用x±s表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行處理, 用SNK法進(jìn)行多個樣本均數(shù)的方差分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MNU誘發(fā)膀胱腫瘤情況

解剖切開膀胱發(fā)現(xiàn)膀胱壁增厚、蒼白、菜花狀新生物形成，絕大多數(shù)為多發(fā)腫瘤。HE 染色結(jié)果:移行上皮結(jié)構(gòu)特征部分消失，呈彌漫分布或排列成實(shí)體性癌灶。細(xì)胞異形明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，排列紊亂，極向消失，核畸形，核漿比例大，核分裂像明顯。

2.2 塞來昔布及卡介苗的抑瘤作用

2.2.1免疫組化檢測計(jì)數(shù)結(jié)果（表1）

各組均出現(xiàn)不同程度的免疫細(xì)胞浸潤呈棕褐色染色（圖1～3）。每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)數(shù)3個視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率。其余3組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的浸潤百分比與PBS組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組與卡介苗組及塞來昔布組比較，免疫細(xì)胞浸潤更明顯（P<0.05），聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞在腫瘤組織局部的作用。

2.2.2凋亡細(xì)胞檢測計(jì)數(shù)結(jié)果（表1）

各組均出現(xiàn)不同程度的腫瘤細(xì)胞核呈棕褐色染色（圖4）。其他實(shí)驗(yàn)組AI均明顯高于PBS組（P<0.05）。且聯(lián)合用藥組與卡介苗組及塞來昔布組比較凋亡更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，以卡介苗為基礎(chǔ)的聯(lián)合灌注治療能夠明顯地延長膀胱癌患者的總體生存時間?？ń槊绨l(fā)揮抗癌作用的主要方式是通過激活免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用[1]。

近期研究表明,在淺表性膀胱癌和人類其他腫瘤的癌組織和細(xì)胞系中檢測到COX-2 蛋白及分子水平都有高表達(dá)[2-4]。COX-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGE2分泌增加與機(jī)體免疫抑制相關(guān)，PGE2能降低機(jī)體的抗腫瘤免疫而促進(jìn)腫瘤的生長[5]。研究認(rèn)為，塞來昔布抗腫瘤效應(yīng)主要是通過降低PGE2水平從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能來起作用的。

研究表明，在BCG激活的膀胱腫瘤局部免疫中，CD4+T細(xì)胞在膀胱黏膜下層的浸潤是最重要的，CD4+T細(xì)胞的表達(dá)量直接關(guān)系到BCG激活的免疫系統(tǒng)的效能[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+T細(xì)胞比單獨(dú)用藥組有顯著的增長，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量用藥組比PBS組均減小，聯(lián)合用藥組減少更顯著。研究表明，CD8+T細(xì)胞在用藥治療早期是升高的，但是治療后期會下降，這與大量的CD8+T細(xì)胞作用于腫瘤細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，自身也崩解、凋亡有關(guān)。塞來昔布組與PBS組比較，腫瘤免疫細(xì)胞的表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明在無BCG激活局部免疫反應(yīng)的條件下，使用塞來昔布難以充分調(diào)動機(jī)體的免疫反應(yīng)，其抗腫瘤效應(yīng)主要是通過抑制PGE2的產(chǎn)生從而提高腫瘤定向細(xì)胞毒性作用[7]。說明聯(lián)合使用塞來昔布和卡介苗可以更大地激活免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性。

凋亡細(xì)胞指數(shù)是衡量組織中細(xì)胞凋亡發(fā)生程度的一項(xiàng)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法檢測各組腫瘤組織的凋亡細(xì)胞，觀察藥物對腫瘤細(xì)胞的凋亡和生長抑制的影響。本研究中，聯(lián)合用藥組的AI值明顯高于其他各組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明聯(lián)合塞來昔布和卡介苗能顯著增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其分化增值。

綜上所述，塞來昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱腫瘤，比單純使用卡介苗及塞來昔布更有效，但要成為一種新的膀胱腫瘤的治療方法，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)和研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]任黎剛,汪朔,謝立平.卡介苗治療膀胱腫瘤機(jī)理的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·泌尿系統(tǒng)分冊,2003,23(2):147-148.

[2]Shigemass K,Tian X,Gu L,et al.Cyclooxygenase-2 and its relationship to p53 accumulation in ovarian adenocarcinomas[J].Int J Oncol,2003,22(1):99-105.

[3]余文輝,周小梅,李卓華,等.子宮頸、子宮內(nèi)膜和卵巢癌中COX-2的測定及其意義[J].中國醫(yī)師雜志,2005,7(4):467-469.

[4]Ohd JF,Nielsen CK,Campbell J,et al.Expression of the leukotriene D4

receptor CysLT1,COX-2,and other cell survival factors in colorectal adenocarcinamas[J].Castroenterology,2003,124:57-70.

[5]Pockaj BA,Basu GD,Pat hangey LB,et al.Reduced T-cell and dendritic cell function is related to cyclooxygenase-2 overexpression and prostaglandin E2 secretion in patients with breast cancer[J].Ann Surg Oncol,2004,11(3):328-339.

[6]Jacoby RF,Cole CE,Tutsch K,et al.Chemopreventive efficacy of combined piroxicam and difluoro methylornithine treatment of Apc mutant Min mouse adenomas,and selective toxicity against Apc mutant embryos[J].Cancer. Res,2000,60(7):1864-1870.

[7]Ristimaki A,Nieminen O, SauKkonen K,et al.Expression of Cyclooxygenase-2 in Human Transitional Cell Carcinoma of the Urinary Bladder[J].AM J Pat hol,2001,15(8):849-853.

（收稿日期：2009-03-16）