吳 格 陳圣崴 陳 明

摘要蜂蜜中替硝唑藥物使用的停藥安全期和殘留量的高效液相色譜檢測方法的試驗(yàn)研究結(jié)果表明,替硝唑濃度在0.05～2.50μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,平均回收率為93.4%~99.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%~5.31%,最低檢測限為0.01μg/mL。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確。替硝唑施藥濃度為2.0g/L時(shí),停藥安全期是15d以上;施用濃度5.0g/L時(shí),停藥安全期是25d以上。

關(guān)鍵詞蜂蜜;替硝唑;殘留量;高效液相色譜;停藥安全期

中圖分類號(hào)S859.84 ;S896.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)21-0287-03

我國蜂產(chǎn)品年產(chǎn)量及出口量均居世界前列。但由于蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥物殘留超標(biāo),出口屢屢受阻。進(jìn)口國紛紛采取了封關(guān)、扣留及銷毀產(chǎn)品等措施。給我國養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大影響。近幾年,中國加強(qiáng)了對(duì)蜂產(chǎn)品中藥物殘留的控制管理。雖然目前歐盟等國有限度解除了對(duì)中國蜂產(chǎn)品的進(jìn)口禁令,但它對(duì)進(jìn)口的蜂產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷提高,其中的禁用藥物種類逐年增加。因此,為了應(yīng)對(duì)國外的“綠色壁壘”,也為了提高我國蜂產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量,要加強(qiáng)蜂產(chǎn)品中藥物殘留研究工作的技術(shù)儲(chǔ)備,迅速提高自身水平,主動(dòng)適應(yīng)國際間對(duì)此類產(chǎn)品日益提高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

南京外國語學(xué)校科研實(shí)習(xí)小組在飼養(yǎng)蜜蜂的觀察研究試驗(yàn)中,了解到蜜蜂爬蜂病是我國近年來西方蜜蜂普遍發(fā)生的疾病,秋冬兩季尤為嚴(yán)重,患病蜜蜂輕者群勢迅速削弱,重者全群覆滅,給蜂農(nóng)帶來巨大損失。以前蜜蜂爬蜂病主要使用氯霉素、甲硝唑治療,在國家明令禁止在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用氯霉素、洛硝達(dá)唑等藥,歐盟又禁用甲硝唑后,沒有列為禁藥的替硝唑成為治療爬蜂病的主要藥物。替硝唑(Tinidazole)別名磺甲硝咪唑(Fasigyn),是一種人工合成的抗生素,屬于硝基咪唑類藥物,具有抗厭氧菌和抗原蟲的作用。它單獨(dú)使用或和其他藥物配合使用,對(duì)防治各種蜂病都有一定療效,因此目前在我國養(yǎng)蜂業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。我國和歐盟、日本、美國對(duì)抗生素藥物在動(dòng)物源食品中的使用及殘留都有相應(yīng)的規(guī)定,但對(duì)于取代氯霉素、甲硝唑成為防治蜜蜂爬蜂病主要藥物之一的替硝唑,我國目前還沒有關(guān)于蜂蜜中替硝唑殘留量測定的國家、行業(yè)或地方檢測方法標(biāo)準(zhǔn),也沒有相應(yīng)的藥物使用規(guī)范。蜂農(nóng)經(jīng)常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)自行添加使用,也沒有相應(yīng)的停藥安全期。往往造成蜂產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo),影響蜂蜜產(chǎn)品品質(zhì)。

目前國內(nèi)外對(duì)替硝唑分析檢測方法,主要有紫外分光光度法、熒光分光光度法、酶聯(lián)法、液相色譜法、火焰原子吸收光譜法、膠束薄層法等。多出現(xiàn)在對(duì)替硝唑原料藥和成藥的檢測,以及藥物在人體中的藥物動(dòng)力學(xué)和藥物代謝檢測研究。筆者采用高效液相色譜法檢測蜂蜜中替硝唑的殘留量,樣品經(jīng)溶劑提取、離心沉淀、凈化、濃縮。在C18色譜柱上分離,紫外檢測器測定,可以一次性定性定量檢測蜂蜜中替硝唑的藥物殘留量,方法簡單快捷,為研究替硝唑在蜂蜜中的藥物殘留消減規(guī)律提供了技術(shù)依據(jù)。該試驗(yàn)研究了在飼養(yǎng)蜜蜂過程中,當(dāng)施用不同濃度的替硝唑藥液后,蜂蜜中替硝唑殘留量的消減規(guī)律。初步確定不同替硝唑施藥濃度的停藥安全期。

1材料與方法

1.1儀器設(shè)備、藥品及試劑

Agilent1100S高效液相色譜儀(美國,Agilent公司),配備四元泵,二極管矩陣檢測器(DAD);Lamda25紫外分光光度計(jì)(美國,PE公司);N-EVEP 112氮吹儀(美國,Organom ation Associates公司);Milli-Q超純水器 (美國,MILLLIPORE公司)等。

替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品:≥99.5%(Sigma公司產(chǎn)品);所用試劑磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、鹽酸等為分析純,甲醇為色譜純,水為超純水。

1.2各種溶液的配制

替硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0g,用甲醇溶解,定容至100mL棕色容量瓶,此替硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1mg/mL。放置4℃冰箱中保存,可以使用2個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇∶水(20/80;V/V)溶液稀釋至所需的質(zhì)量濃度。置于4℃條件下避光保存,有效期為20d。

1.3色譜檢測條件

高效液相色譜儀配備二極管矩陣檢測器,檢測波長316nm;色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,i.d,5μm),柱溫25℃;流動(dòng)相:甲醇+水=20+80;流速1.0 mL/min,樣品進(jìn)樣量為20μL。

1.4試驗(yàn)方法

將替硝唑原藥用水配制成2.0g/L、5.0g/L 2種濃度的溶液,對(duì)無藥物污染的新蜂巢脾板分別進(jìn)行噴霧施藥后,放入2個(gè)不同的蜂箱,替換出舊的脾板。然后每天施藥1次,共計(jì)3d。停藥后第3天、第8天、第15天、第25天采集脾板上的蜂蜜,檢測其替硝唑藥物殘留含量。

1.5樣品處理

準(zhǔn)確稱取10.0g(精確至0.001g)混勻的蜂蜜,放入50mL離心管,加入10mL超純水,振蕩溶解。加入磷酸氫二鉀5g,漩渦振蕩5min使其溶解。加入10mL乙酸乙酯萃取,漩渦振蕩5min,高速離心(10 000rpm)5min。吸取上層有機(jī)相;分別用8mL、4mL乙酸乙酯重復(fù)萃取操作步驟2次。將3次有機(jī)相合并后使用氮?dú)獯蹈蓛x在40℃水浴下吹干,用1mL的20%甲醇水溶液溶解定容,用0.22μm針式濾器過濾,最后用高效液相色譜儀測定。

樣品加標(biāo)試驗(yàn):稱取空白樣品后,加入適量濃度的替硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液,其他處理步驟同上。

2結(jié)果與分析

2.1色譜分析條件

2.1.1檢測波長的選擇。用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長掃描(190～600nm),檢測波長選擇試驗(yàn)結(jié)果表明,替硝唑在190～600nm范圍內(nèi)最大吸收峰在316nm處。因此,選擇高效液相色譜儀二極管矩陣檢測器(DAD),檢測波長為316nm,同時(shí)可以避免低波長紫外下雜質(zhì)干擾檢測。

2.1.2流動(dòng)相對(duì)替硝唑分離的影響。在高效液相色譜的分析中,流動(dòng)相中甲醇濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%變化時(shí),替硝唑在C18反相分析柱上的保留時(shí)間變短。甲醇濃度太低,分析時(shí)間延長,替硝唑峰形變寬拖尾;甲醇濃度太高,分析時(shí)間太短,樣品中干擾物質(zhì)和替硝唑的分離不好。經(jīng)過試驗(yàn),甲醇濃度以20%為宜。

2.1.3溫度對(duì)保留時(shí)間的影響。研究發(fā)現(xiàn),不同的分析柱溫會(huì)使替硝唑色譜圖出峰保留時(shí)間變化,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度變化也是干擾色譜分析條件的因素之一,影響分離效果和檢測準(zhǔn)確性,應(yīng)該引起試驗(yàn)測試者足夠重視。因此,該試驗(yàn)建議分析檢測方法,分析柱溫設(shè)定為25℃,液相色譜儀器實(shí)驗(yàn)室溫度也應(yīng)控制在恒溫條件下開展(23~25℃)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限

準(zhǔn)確吸取一定體積的替硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用20%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋,分別配制成濃度為0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL、2.50μg/mL的替硝唑標(biāo)準(zhǔn)工作液,此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。按上述的色譜分析條件,每個(gè)濃度測定3次,取測得的峰面積平均值和替硝唑的濃度關(guān)系作線性回歸分析,結(jié)果表明:替硝唑質(zhì)量濃度(C)在0.05～2.50μg/mL范圍內(nèi)與峰面積(A)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:C=0.028 8A-0.001 89,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8。

在藥物殘留的檢測中,檢測限是主要的技術(shù)指標(biāo)之一。是考察檢測替硝唑殘留量的最低濃度有效值。以3倍于噪音峰高的替硝唑濃度響應(yīng)值作為最低檢測限,該分析條件下替硝唑的最低檢測限為0.01μg/mL。

2.3樣品前處理方法

高效液相色譜分析,需要對(duì)樣品進(jìn)行一定的處理和凈化、富集。以減少雜質(zhì)對(duì)分離檢測時(shí)的干擾和提高藥物殘留的檢測限。因此,需要研究樣品的前處理?xiàng)l件,以凈化除去可能會(huì)干擾檢測的樣品基質(zhì)中雜質(zhì)。液液萃取法是化學(xué)分析中常用的分離方法,目前國內(nèi)外有關(guān)硝基咪唑類藥物分析樣品前處理使用最廣的提取溶劑一般有乙酸乙酯、乙腈、甲苯和二氯甲烷。二氯甲烷毒性較大;而通常情況下,乙腈與水相互溶,不便于進(jìn)一步分離提取目標(biāo)物。因此,選擇采用乙酸乙酯作為蜂蜜中替硝唑的萃取溶劑。通過振蕩、超聲、高速離心的方法進(jìn)行提取分離。

蜂蜜樣品在添加水溶解后直接用乙酸乙酯提取,發(fā)現(xiàn)高速離心后,兩相液面有較厚的乳化層,影響萃取分離。當(dāng)添加一定的磷酸氫二鉀鹽后,乳化層減弱。為了研究添加磷酸鹽對(duì)液液萃取效率的影響,試驗(yàn)設(shè)計(jì)了2g、5g、10g等3種添加量。考察了對(duì)方法回收率高低的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(見表1),建議采用添加5g磷酸氫二鉀。

2.4回收率

在上述色譜條件下,分別在未含替硝唑藥物殘留的空白蜂蜜樣品中,添加0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg 3個(gè)濃度水平的替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)濃度水平做3個(gè)重復(fù)。測得蜂蜜中替硝唑的平均回收率為93.4%~99.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%~5.31%。表明該方法準(zhǔn)確度和精確度能滿足蜂蜜中替硝唑殘留的分析要求(見圖1、圖2)。

2.5停藥安全期

將采集的蜂蜜樣品按確定的試驗(yàn)條件處理并通過高效液相色譜分析檢測,結(jié)果見表2、表3。

從試驗(yàn)結(jié)果可以初步看出,施用替硝唑后,蜂蜜中替硝唑的濃度含量隨著時(shí)間逐漸消減。2.0g/L濃度的替硝唑原藥施用后,在15d后蜂蜜中的替硝唑殘留量消減到不能檢出,而5.0g/L濃度的替硝唑原藥施用后,到第25天蜂蜜中替硝唑殘留量消減到不能檢出。因此,可以初步確定當(dāng)替硝唑的施藥濃度是2.0g/L時(shí),停藥的安全期是15d以上。而當(dāng)施用5.0g/L濃度的替硝唑藥液時(shí),停藥的安全期是25d以上。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)建立了蜂蜜中替硝唑藥物殘留的高效液相色譜檢測方法和樣品分離、純化、富集的前處理方法。檢測中基本無雜質(zhì)干擾檢測,樣品峰分離效果好,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。替硝唑濃度在0.05～2.50μg/mL范圍內(nèi)時(shí),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。在空白樣品中添加替硝唑濃度為0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg時(shí),替硝唑的平均回收率為93.4%~99.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%~5.31%。符合殘留檢測要求。檢驗(yàn)過程樣品處理步驟簡單,分析時(shí)間短,結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠,可滿足對(duì)蜂蜜中替硝唑藥物殘留量的檢測。替硝唑的藥物施用試驗(yàn),初步探討了該藥物在防治蜂病時(shí)的藥物施用濃度和停藥安全期,為加強(qiáng)蜂產(chǎn)品的藥物使用監(jiān)管和殘留監(jiān)測,保證蜂產(chǎn)品質(zhì)量提供一定的技術(shù)依據(jù),能夠提高我國蜂產(chǎn)品的出口競爭力,從而使我國的蜜蜂產(chǎn)業(yè)突破國外的“技術(shù)壁壘”,順利地跨出國門,走向世界。

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