李仕金 辛培堯 周 軍

摘要對(duì)國(guó)內(nèi)外幾種主要的麻類作物基因工程研究進(jìn)行了綜述,并對(duì)今后麻類作物在該領(lǐng)域的工作提出了展望。

關(guān)鍵詞麻類作物;基因工程;育種;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)S563;Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)08-0105-02

麻是一種古老的纖維植物,主要有紅麻(Hibiscus cannab-inus)、黃麻(Corchorus capsularis)、亞麻(Linum numusitatissimum)、苧麻(Boehmeria nivea)、大麻(Cannabis stative)等,它們?cè)谥参锓诸愔胁⒉粚儆谕豢苹驅(qū)?但它們都有質(zhì)地堅(jiān)韌的纖維,可作為紡織業(yè)和造紙業(yè)的原材料。我國(guó)是世界主要產(chǎn)麻國(guó)之一,也是麻類作物品種最多的國(guó)家。麻類作物還是包裝及繩索等制造工業(yè)的重要原料,是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。因此,愈來(lái)愈多的科研工作者對(duì)麻類作物進(jìn)行了利用各種手段改良其產(chǎn)量及品質(zhì)的研究工作。

基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合,并使之滲入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi),且能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖[1]。自1983年利用基因工程手段首次獲得轉(zhuǎn)基因植株以來(lái)(煙草),這一技術(shù)在短短的20多年時(shí)間里得到了迅猛發(fā)展。到2001年,全球共正式批準(zhǔn)各種轉(zhuǎn)基因植物120多個(gè)品種(系),已有15個(gè)以上的國(guó)家種植轉(zhuǎn)基因植物,總面積已超過(guò)5 200萬(wàn)公頃[2]。1983年Hepburn等用根癌農(nóng)桿菌侵染亞麻上胚軸得到亞麻腫瘤株系,自此開(kāi)始了麻類作物基因工程的育種研究?；蚬こ虘?yīng)用于麻類作物,在其種質(zhì)資源的創(chuàng)新中逐漸顯示出了強(qiáng)大的生命力和巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1抗病蟲(chóng)害基因工程方面的研究

經(jīng)過(guò)多年的相關(guān)研究,國(guó)內(nèi)外研究工作者在紅麻、亞麻、苧麻等麻類作物的抗病蟲(chóng)害轉(zhuǎn)基因研究中取得了可喜的成就。其中以紅麻轉(zhuǎn)抗病蟲(chóng)基因工程研究居多。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所與國(guó)際黃麻組織(IJO)合作,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗真菌病害基因(幾丁質(zhì)酶基因與β-1, 3-葡聚糖酶基因)和抗蟲(chóng)基因(Bt基因)導(dǎo)入紅麻子葉細(xì)胞,得到了轉(zhuǎn)基因后代植株[3]。據(jù)報(bào)道,福建農(nóng)林大學(xué)的研究者利用雙價(jià)抗蟲(chóng)基因Pta-3300-Bt混合導(dǎo)入紅麻優(yōu)良品種中,已獲得1 500多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系,正在進(jìn)行株系的田間和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的系統(tǒng)鑒定,有望選育出抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因紅麻新品種[4]。祁建民等用花粉管法將抗蟲(chóng)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體紅麻品種福紅952,在受體品種中獲得了Bt抗蟲(chóng)目的基因的表達(dá)。分別用PCR和Southern雜交技術(shù),對(duì)所轉(zhuǎn)化的紅麻轉(zhuǎn)基因4個(gè)世代的株系進(jìn)行分子驗(yàn)證,結(jié)果在4個(gè)世代中都檢測(cè)到Bt抗蟲(chóng)目的基因片段,說(shuō)明外源基因已經(jīng)整合到紅麻的基因組中并獲得了穩(wěn)定遺傳[5]。

亞麻方面,王毓美等用含有幾丁質(zhì)酶(rc24)基因(上游為CaMV35S啟動(dòng)子和Act1啟動(dòng)子,下游為NOS終止子)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt 1I)基因的農(nóng)桿菌LBA4404內(nèi)含已去除了T-DNA上致癌基因的pYAO24質(zhì)粒為供體進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)化,得到了具有100mg/L抗性的轉(zhuǎn)化植株;對(duì)植株葉片愈傷組織的過(guò)氧化物酶及酯酶同工酶分析表明轉(zhuǎn)化株與對(duì)照系具有明顯的差異,推斷幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)進(jìn)入亞麻基因組[6]。

苧麻抗病蟲(chóng)害轉(zhuǎn)基因研究也取得了一定的進(jìn)展。陳建榮等用農(nóng)桿菌LBA4404(pBI121-antiBNCCoA OMT)侵染苧麻的試管苗葉片,建立了苧麻葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了抗卡那霉素植株[7]?？兹A等通過(guò)含有輪狀病毒外殼抗原蛋白VP4基因的根癌農(nóng)桿菌,用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化苧麻栽培品種圓葉青,初步獲得了輪狀病毒外殼蛋白VP4的轉(zhuǎn)基因苧麻植株[8]。另有研究者通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)肫r麻體內(nèi),獲得了16株轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)點(diǎn)雜交和PCR-Southern分析,有12株苧麻轉(zhuǎn)化植株基因組中整合有外源Bt基因[9]。上述研究成果,為麻類作物抗病蟲(chóng)害轉(zhuǎn)基因新品種以及種質(zhì)資源的創(chuàng)新奠定了初步的物質(zhì)基礎(chǔ),也為該領(lǐng)域的研究提供了經(jīng)驗(yàn)以及理論基礎(chǔ)。

2抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究

麻類作物中,抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究目前只在紅麻、亞麻中取得了一些成就,其他麻類作物的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

曹德菊等用花粉管法將外源抗除草劑Bar基因?qū)爰t麻,并對(duì)有效導(dǎo)入方法及參數(shù)進(jìn)行了研究,通過(guò)PCR檢測(cè)及Southern雜交對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)抗除草劑基因紅麻進(jìn)行了分子水平的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)外源抗除草劑基因已整合進(jìn)紅麻基因組中[10,11]。王玉富等以纖維用亞麻品種黑亞11號(hào)為材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bar基因轉(zhuǎn)入亞麻,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的基因已經(jīng)整合到亞麻基因組中[12]。隨著除草劑的廣泛使用,其藥害已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一,危害僅次于有害生物造成的損失。因此,開(kāi)展抗除草劑育種,是作物育種的新育種目標(biāo)之一,該方面的研究有待加強(qiáng)。作為一種新的育種輔助手段,基因工程憑借其目的性強(qiáng)的優(yōu)越性,必將在這一研究領(lǐng)域取得更大的成功。

3抗逆性轉(zhuǎn)基因研究

干旱、病蟲(chóng)害、草害、凍害及鹽堿害等脅迫因子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)的危害相當(dāng)巨大,每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)萬(wàn)美元,且有逐年增加的趨勢(shì)。因此,培育抗逆性作物新品種,是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的必由之路,在目前全球氣候惡化的情況下,更具有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。目前,各種作物都已開(kāi)展了抗逆性轉(zhuǎn)基因育種,并取得一定的成就,而麻類作物的抗逆性轉(zhuǎn)基因研究主要在紅麻、亞麻中有見(jiàn)報(bào)道。

福建農(nóng)林大學(xué)用花粉管通道法將耐鹽基因SaNHXP導(dǎo)入優(yōu)良紅麻品種福紅992,從1 500個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中篩選出5個(gè)耐7‰鹽堿度的抗鹽堿植株,目前正在進(jìn)行田間和室內(nèi)鑒定試驗(yàn)[4]?？祽c華等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗鹽和低溫脅迫基因HY15CS導(dǎo)入單倍體亞麻,獲得抗性再生植株24株,從15株生長(zhǎng)健壯的再生植株中用PCR檢測(cè)到3株陽(yáng)性植株,陽(yáng)性率達(dá)20%[13]。

4品質(zhì)育種轉(zhuǎn)基因研究

麻類作物品質(zhì)育種基因工程方面的報(bào)道較少,僅紅麻和黃麻各1例。浙江省蕭山棉麻研究所以改良紅麻纖維品質(zhì)為目的的外源DNA導(dǎo)入紅麻獲得了成功[14]。林荔輝等將黃麻基因組DNA通過(guò)花粉管通道法導(dǎo)入紅麻中,并首次獲得2份莖稈光滑無(wú)刺的稀有紅麻早熟突變體901和902,并通過(guò)雜交、回交和多代定向選擇的遺傳改良,育成了莖桿光滑無(wú)刺的紅麻新型品種金山無(wú)刺,并從中選育出中偏遲熟油麻兼用紅麻新型品種金光1號(hào)[15]。

5麻類作物相關(guān)基因克隆方面

麻類作物基因克隆的研究?jī)?nèi)容,主要集中于亞麻和苧麻2種作物。亞麻是一種重要的韌皮纖維作物,木質(zhì)素對(duì)亞麻纖維的性能和品質(zhì)具有較大影響。高原等以亞麻莖桿表皮細(xì)胞的mRNA為模板,利用木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的同源基因保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增,獲得了8個(gè)關(guān)鍵酶基因新的片段序列。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,這些新片段分別屬于3個(gè)基因家族。他們推測(cè)亞麻中這幾個(gè)木質(zhì)素代謝關(guān)鍵調(diào)控酶基因存在多基因家族。新獲得的基因片段序列為進(jìn)一步克隆全序列和了解調(diào)控亞麻木質(zhì)素的生物合成奠定了基礎(chǔ)[16]。另有研究者以亞麻為材料,研究木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶亞麻肉桂醇脫氫酶基因序列。分離了高純度的RNA,以RNA為模板,用簡(jiǎn)并引物以RT- PCR的方法,克隆了亞麻CAD基因cDNA部分序列,長(zhǎng)度為477bp,編碼159個(gè)氨基酸殘基,此cDNA序列為亞麻CAD基因序列[17]。

苧麻方面,陳建榮等用RT-PCR方法克隆了嫻草木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶咖啡酰甲基轉(zhuǎn)移酶(eafeoyl-CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT)基因,構(gòu)建了CCoAOMT基因反義表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)苧麻進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到了轉(zhuǎn)基因植株,并用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分子檢測(cè)[18]。有人利用RT-PCR法結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)從苧麻中克隆了與木質(zhì)素合成相關(guān)的COMT基因的全長(zhǎng)cDNA序列。相似性比對(duì)結(jié)果表明,苧麻COMT全長(zhǎng)cDNA與楊樹(shù)COMT基因的序列同源性達(dá)82%,其編碼的氨基酸序列與杏的COMT氨基酸序列同源性最高,達(dá)93%[19]。黃妤等以苧麻栽培種湘苧3號(hào)為材料,通過(guò)簡(jiǎn)并引物RT-PCR結(jié)合RACE 技術(shù)克隆了苧麻生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP1基因的全長(zhǎng)cDNA分子。經(jīng)基因比對(duì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與已報(bào)道的幾種植物生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白有高同源性,認(rèn)為是苧麻生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因cDNA并命名為BnABP1[20]。也有人依照已克隆的苧麻CCoAOMT(咖啡酰輔酶-A-氧甲基轉(zhuǎn)移酶)基因cDNA序列,以其編碼纖維素合成酶底物結(jié)合和催化合成結(jié)構(gòu)域的cDNA序列為目標(biāo),采用PCR擴(kuò)增方法引入克隆的酶切位點(diǎn),分別將其正、反方向克隆到植物RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒PFGC5941 T-DNA上CHSA內(nèi)含子兩側(cè),構(gòu)建了植物表達(dá)苧麻CCoAOMT基因的干擾重組Ti載體[21]。

6其他方面研究

與此同時(shí),麻類作物基因工程育種在其他方面也取得了喜人的成就。

劉燕等[22]、王玉富等[23]用微注射法將外源DNA 通過(guò)花粉管導(dǎo)入亞麻,并得到了過(guò)氧化物同工酶酶譜明顯變異的后代。姬妍茹等采用直接分化再生系統(tǒng)為轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GUS 基因?qū)雭喡槠贩N雙亞5號(hào)和雙亞7號(hào)的下胚軸段中,經(jīng)過(guò)不到2個(gè)月的時(shí)間即獲得再生苗。這一成果大大縮短了遺傳轉(zhuǎn)化所需時(shí)間,為亞麻轉(zhuǎn)基因育種提供了一條快捷的途徑[24]。也有研究人員用超干胚浸漬法將棉花DNA導(dǎo)入苧麻種子,在D1代,發(fā)現(xiàn)了在葉片的缺刻、茸毛上存在差異的變異株;而在D2代,則發(fā)現(xiàn)了在株高上有明顯不同的植株。經(jīng)過(guò)RAPD驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)有的變異株中出現(xiàn)了棉花的特異帶,有的則出現(xiàn)受體和供體均沒(méi)有的新帶,還有的出現(xiàn)了受體DNA帶在變異株中消失的情況[25]。另外,汪波等以苧麻優(yōu)良品系“5041-3”子葉作為受體,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了綠色熒光蛋白基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究,并將外源基因整合到苧麻基因組中[26]。陳德福等分別用根癌農(nóng)桿菌C58C1和發(fā)根農(nóng)桿菌A4轉(zhuǎn)化苧麻“湘苧3號(hào)”種子苗繁殖的試管苗葉切片。根癌農(nóng)桿菌C58C1感染的葉切片在12d時(shí),即有肉眼可見(jiàn)的的愈傷組織產(chǎn)生。發(fā)根農(nóng)桿菌A4轉(zhuǎn)化的葉片在第21天時(shí)無(wú)愈傷組織產(chǎn)生,但有少量根產(chǎn)生[27]。

麻類作物該方面的研究為利用轉(zhuǎn)基因方法創(chuàng)造麻類作物新品種的育種工作,提供了豐富的前期基礎(chǔ)。

7展望

麻類作物是重要的纖維和油料作物,對(duì)它進(jìn)行基因工程方面的研究有著重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)目的基因的分離、改造、利用,培育出具有改良的纖維及種子品質(zhì)的工程植株并使之應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,可提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入,改善生態(tài)環(huán)境。目前,對(duì)麻類作的轉(zhuǎn)基因育種研究,與棉花和油料等相比,還處于深入起步階段。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和完善,會(huì)有越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因麻類植物新品種出現(xiàn),到時(shí)將大大提高麻類作物的利用價(jià)值。如在改善纖維品質(zhì)方面,若能把控制品質(zhì)的關(guān)鍵基因定位并加以克隆,有望大幅提升麻類纖維質(zhì)量。對(duì)大麻中有毒成分THC的合成關(guān)鍵酶基因定位克隆,并對(duì)其活性進(jìn)行深入的研究,則有望培育出無(wú)毒或低毒大麻,從而使大麻這種古老經(jīng)濟(jì)作物的種植不再受限。可以預(yù)見(jiàn),基因工程手段應(yīng)用于麻類作物,具有巨大的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

8參考文獻(xiàn)

[1] 胡延吉.植物育種學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2003.

[2] 閆新甫.轉(zhuǎn)基因植物[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[3] 陳建華,臧鞏固,李育君.植物基因工程研究成果及其在麻類作物育種上的應(yīng)用前景[J].中國(guó)麻作,2000,22(4):1-4.

(下轉(zhuǎn)第109頁(yè))

(上接第106頁(yè))

[4] 祁偉,徐建堂,祁建民.黃/紅麻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué),2007,29(S2):404-407,424.

[5] 祁建民,徐建堂,林荔輝,等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)紅麻福紅952后代的分子雜交驗(yàn)證[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,37(1):77-79.

[6] 王毓美,徐云遠(yuǎn),賈敬芬.亞麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲难芯縖J]. 西北植物學(xué)報(bào),2000,20(3):346-351.

[7] 陳建榮,郭清泉,張學(xué)文,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)苧麻葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(6):63-66.

[8] 孔華,郭安平,郭運(yùn)玲.輪狀病毒外殼抗原蛋白VP4基因轉(zhuǎn)化苧麻的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(24):6460-6462,6464.

[9] 易自力,李祥,蔣建雄,等.苧麻再生體系的建立及抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因苧麻的獲得[J].中國(guó)麻業(yè),2006,28(2):61-66.

[10] 曹德菊,程備久,徐明照,等.花粉管法將外源除草劑基因?qū)爰t麻的有效方法及參數(shù)研究[J].中國(guó)麻業(yè),2000,22(1):1-13.

[11] 曹德菊,程備久,林毅,等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因紅麻的分子驗(yàn)證[J].中國(guó)麻業(yè),2001,23(3):1-4.

[12] 王玉富,康慶華,李希臣,等.亞麻抗除草劑轉(zhuǎn)基因的分子檢測(cè)[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué),2008,30(1):13-16.

[13] 康慶華,許修宏,李柱鋼,等.亞麻單倍體抗逆基因的轉(zhuǎn)化[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué),2006,28(6):291-296.

[14] 張福泉,李宗道.麻類作物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),1999(5):4-6.

[15] 林荔輝,祁建民,方平平,等.紅麻無(wú)刺新型品種金光1號(hào)的選育[J].中國(guó)麻業(yè),2001,23(3):1-4.

[16] 高原,陳信波,龍松華,等.亞麻木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶基因片段的克隆與序列分析[J].作物學(xué)報(bào),2008,34(2):337-340.

[17] 黃海燕,王玉富,薛召東,等.亞麻CAD基因克隆及序列分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(5):496-498.

[18] 陳建榮,張學(xué)文,郭清泉,等.CCoAOMT基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化苧麻的研究[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(1):75-78.

[19] 黃春瓊,郭安平,章霄云,等.苧麻COMT基因的克隆及序列分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,24(5):386-391.

[20] 黃妤,劉峰,郭清泉,等.苧麻生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及表達(dá)[J].作物學(xué)報(bào),2008,34(8):1358-1365.

[21] 鄧晶,劉峰,郭清泉,等.苧麻CCoAOMT基因干擾表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,34(2):132-135.

[22] 劉燕,王玉富,關(guān)鳳芝,等.亞麻外源DNA導(dǎo)入的適宜時(shí)期與方法的研究[J].中國(guó)麻作,1997,19(3):13-15.

[23] 王玉富,劉燕,喬廣軍,等.亞麻外源DNA 導(dǎo)入后代的過(guò)氧化物同工酶分析[J].中國(guó)麻作,1996,18(3):66-68.

[24] 姬妍茹,趙軍,劉偉偉,等.應(yīng)用直接分化再生系統(tǒng)進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2008(1):128-132.

[25] 張福泉,蔣建雄,李宗道,等.棉花DNA導(dǎo)入苧麻引起變異的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,33(1):103-106.

[26] 汪波,彭定祥,孫珍夏,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)苧麻轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)基因植株再生[J].作物學(xué)報(bào),2007,33(10):1606-1610.

[27] 陳德富,陳喜文.苧麻外源基因?qū)胙芯亢?jiǎn)報(bào)[M]∥李宗道.苧麻生物技術(shù)研究進(jìn)展.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1996.