殷 江

摘要：目的建立不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測(cè)定方法。方法采用RP-HPLC法，以甲醇－水(32:68)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm測(cè)葛根素含量，紫外分光光度法測(cè)柴葛、粉葛中總黃酮含量。結(jié)果葛根索峰分離度提高，峰形改善；葛裉素0.204～2.04ug范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.9999)，回收率為98.7％(n=5)，精密度RSD=0.86％。總黃酮濃度在4.08～16.32ug／ml范圍內(nèi)與吸收度線性關(guān)系良好(r=0.9998)。結(jié)論該法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好，可用于中藥葛根藥材及飲片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：葛根葛根素含量分析

0引言

葛根為豆科植物柴葛和甘葛藤的干燥根，前者習(xí)稱柴葛，甘葛藤習(xí)稱“粉葛”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、辛，性平，具有增加腦及冠狀動(dòng)脈血流量、降低血管阻力、收縮平滑肌、降血糖及解熱等多種功效。民間用于治療傷寒、溫?zé)犷^痛、煩熱消渴等癥，也是中醫(yī)常用的祛風(fēng)解毒藥。現(xiàn)代研究表明，葛根含葛根異黃酮，主要為葛根素、大豆苷、大豆苷元3種活性成分，其中葛根素是本屬的特征成分，也是主要成分，為了對(duì)葛根進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)以葛根素為指標(biāo)，以柴葛、粉葛藥材為對(duì)象，建立了高效液相色譜法測(cè)定其葛根素的含量方法，并采用紫外分光光度法對(duì)其中的總黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定，為柴葛、粉葛的藥材鑒定提供參考方法。

1儀器與材料

1.1儀器美國(guó)Waters公司600-2487高效液相色譜儀，Mil－lenium數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Waters2487紫外檢測(cè)器.島津UV-2401 PC型紫外分光光度計(jì)；島津AY120型萬(wàn)分之一電子分析天平；SB3200型超聲清洗器。

1.2材料葛根素對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇為色譜純：水為重蒸餾超純水；其它試劑均為分析純。柴葛產(chǎn)于安徽岳西，粉葛產(chǎn)于廣西。

2方法與結(jié)果

2.1HPLC法測(cè)定葛根中葛根素的含量

2.1.1色譜條件色譜柱：Zorbax XDB-C18(4.6mm×250mm，5um)；流動(dòng)相：甲醇－水(32:68)；流速1ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm；柱溫22℃；進(jìn)樣體積10ul。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算不低于5000。在該色譜條件下，樣品中的葛根素與其它峰均能達(dá)到基線分離，保留時(shí)間在14.3min左右。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取葛根素對(duì)照品5.1mg，甲醇定容于25ml量瓶。分別移取0.5，1.0，2.0，2.5ml于5ml量瓶，水定容，與原液共同作為HPLC用對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備熱回流提取法：精密稱取柴葛、粉葛粉末(過(guò)50目篩)各0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，稱重。回流提取30min，放冷，稱重并以30％乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液為供試品，待測(cè)。

索氏提取法：稱取柴葛、粉葛粉末各0.5g，精密稱定，以甲醇為提取劑提取4h，過(guò)濾，濃縮提取液并用甲醇定容于10ml量瓶。超聲處理30min，取上清液以水定容于10ml量瓶，待測(cè)。

2.1.4線性關(guān)系考察取對(duì)照品溶液，按照色譜條件進(jìn)樣10ul，葛根素進(jìn)樣量X(ug)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=3.5076×106X+3.2745×104，r=0.9999。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在0.204～2.04ug范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，可用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。

2.1.5精密度考察在色譜條件下，吸取同一對(duì)照品溶液10ul，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積，RSD=0.8％，表明進(jìn)樣與峰面積積分的精密度良好。

2.1.6重復(fù)性考察取同一批柴葛、粉葛樣品5份，按外標(biāo)法計(jì)算含量，RSD=2.8％，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性考察精密吸取對(duì)照品溶液10ul，分別在0，1，2，4，8，12，24，48h時(shí)進(jìn)樣，在色譜條件下測(cè)定峰面積，其RSD值為1.4％。表明葛根素在室內(nèi)正常條件下48h內(nèi)穩(wěn)定，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可以在常溫不避光的條件下操作。

2.1.8回收率考察精密稱取已知葛根素含量的同一樣品藥材粉末5份，20mg／份，精密稱定后，每份加入濃度為0.204mg／ml的對(duì)照品溶液2.5～3.3ml，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，精密吸取10ul，進(jìn)樣，計(jì)算回收率。

2.1.9樣品測(cè)定按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備各樣品溶液，精密吸取10ul，進(jìn)樣，在所選色譜條件下測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。

2.2紫外分光光度法測(cè)定葛根中總黃酮含量

2.2.1線性關(guān)系考察精密稱取葛根素對(duì)照品5.1mg，甲醇定容于25ml量瓶。移取0.2，0.4，0.5，0.6，0.8ml置于10ml量瓶，水定容，為紫外測(cè)總黃酮用對(duì)照品溶液。

以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，得線性方程：Y=0.078X+0.01 52，r=0.9998。表明總黃酮濃度在4.08～16.32ug／ml范圍時(shí)與吸收度線性關(guān)系良好。

2.2.2供試品制備方法1：分別稱取柴葛、粉葛4.5g，置于圓底燒瓶，乙醇回流提取3次，40ml／次，時(shí)間均為1h。合并3次濾液并濃縮置25ml量瓶，乙醇定容。取1ml用乙醇定容于100量瓶，再取1ml上清液于10ml量瓶，水定容，待測(cè)。以1ml乙醇加水定容于10ml量瓶中為空白對(duì)照。

方法2：取上述液相用索氏提取法制得的待測(cè)品0.4ml，置于10ml量瓶，水定容，待測(cè)。

2.2.3吸收波長(zhǎng)考察與樣品測(cè)定在200～800nm間紫外掃描濃度為8.6ug／ml的葛根素對(duì)照品溶液。在249～251nm處有最大吸收，選用250nm測(cè)定。分別測(cè)定兩種方法制得4個(gè)樣品。

3討論

HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地的柴葛、粉葛中的葛根素的含量進(jìn)行了測(cè)定，表明柴葛中葛根素含量約為粉葛的3倍，紫外測(cè)總黃酮含量表明，柴葛中葛根素量占總黃酮量的55％左右，粉葛中葛根素量占其總黃酮量的48％左右。同時(shí)比較了不同提取方法對(duì)葛根素和總黃酮含量測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)回流提取法得到的葛根素含量較高，更有利于其提取。

在葛根素的提取中使用體積分?jǐn)?shù)為30％的乙醇，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)與參閱文獻(xiàn)得出的結(jié)果。此時(shí)總黃酮中的酚羥基主要以離子形式存在，HPLC色譜圖為單峰，而使用60％乙醇提取時(shí)，總黃酮中酚羥基以離子與分子形式共存，色譜圖為雙峰。

葛根素HPLC圖譜中葛根素峰易拖尾，分離度低，本文研究了甲醇：水不同配比對(duì)峰形、分離度和保留時(shí)間的影響，體積比為25:75時(shí)葛根素峰拖尾，與后面的小峰分離度為1.3，體積比為35:65時(shí)葛根索峰與前峰易重合。甲醇:水比(VA／)為32:68時(shí)，在樣品分析中葛根素與其它峰均能達(dá)到基線分寓，保留時(shí)間適中，柱效高，故選用為流動(dòng)相。

此外，比較柴葛與粉葛的圖譜，可發(fā)現(xiàn)其在葛根素及其它成分上均存在較大差別。

本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取方法對(duì)不同品種葛根中葛根素及總黃酮含量測(cè)定的影響，建立了HPLC法測(cè)定柴葛、粉葛中葛根素及UV法測(cè)其總黃酮含量的方法。方法學(xué)考察表明，該法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)單、快速，可作為葛根中藥材及飲片質(zhì)量控制的方法之一。