唐欲博 陳孝 黃保丁 馮鑫 彭龍云 彭新生 鄒學(xué)農(nóng)

基礎(chǔ)研究

人骨髓來源內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的鑒定

唐欲博 陳孝 黃保丁 馮鑫 彭龍云 彭新生 鄒學(xué)農(nóng)

目的建立人骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞（EPCs）分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定的方法，并探討其生物學(xué)特性。方法收集腰椎間盤退變性疾病患者的髂骨骨髓24例，密度梯度離心法分離的單個核細胞接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶，貼壁培養(yǎng)，EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)擴增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙標、流式細胞術(shù)鑒定EPCs，計算純度。透射電鏡和管腔形成實驗鑒定EPCs向血管內(nèi)皮細胞（ECs）分化的能力。結(jié)果培養(yǎng)72 h換液時可見貼壁細胞形成明顯細胞克隆集落，第5天集落數(shù)增加，1周后細胞融合達80%，至第14天細胞呈鋪路石樣排列。培養(yǎng)至第7天細胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色陽性率為（95.1±4.0）%，CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin標記陽性率分別為（18.5±4.4）%、（45.4±7.8）%、（66.7±7.2）%、（20.5±5.3）%。培養(yǎng)第10天細胞透射電鏡顯示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小體。管腔形成實驗表明，體外ECMatrix上培養(yǎng)7至12d的EPCs具有較強的管腔形成能力。結(jié)論采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的人髂骨骨髓來源的單個核細胞在特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPCs，純度較高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。EPCs培養(yǎng)7至12d，具有良好的管腔形成能力。

內(nèi)皮細胞；骨髓細胞；細胞，培養(yǎng)的；細胞分離

內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）的前體細胞，是一群介于血液-血管細胞與成熟內(nèi)皮細胞之間的具有較強增殖分化能力、可向血管新生部位趨化并促進血管新生的幼稚細胞[1，2]。成人EPCs存在于骨髓之中，在機體出現(xiàn)缺血、組織損傷或受到細胞因子、藥物等刺激的情況下，可從骨髓向靶部位動員、歸巢、分化，形成新生血管，因此其在臨床各種缺血性疾病和血管損傷方面有著廣泛的應(yīng)用前景[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs不僅參與胚胎血管生成，還在胎兒出生后的血管新生和血管內(nèi)皮損傷修復(fù)過程中起著重要作用[5-7]。腰椎間盤退變性疾病因其高發(fā)病率和高致殘率，嚴重危害人體健康，造成了沉重的社會負擔。椎間盤內(nèi)無血管組織，其營養(yǎng)來源于經(jīng)軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用。終板血供異常可影響椎間盤基質(zhì)代謝，促使椎間盤退變。本研究采集腰椎退變性疾病患者骨髓進行EPCs的分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定，為研究EPCs在椎間盤退變性疾病的發(fā)病機理及其預(yù)防治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

淋巴細胞分離液（Ficoll-PaquePLUS，GE Healthcare公司），小鼠抗人CD34流式抗體、E-selectin流式抗體（BD公司），CD133流式抗體（Miltenyi公司），VEGFR-2流式抗體（R&D公司），VE-Cadherin、vWF流式抗體（eBioscience公司），Dil-ac-LDL（Molecular Probes公司），F(xiàn)ITC-UEA-I（Vector公司），人纖維連接蛋白（FN，Invitrogen公司），內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基及生長因子套裝（EGM-2 BulletKit）（Lonza公司）；體外血管生成試劑盒（In Vitro Angiogenesis Assay Kit，Milipore公司）；細胞活力和細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）；熒光顯微鏡（LEICA）；流式細胞儀（COULTER）。

1.2方法

1.2.1單個核細胞的分離與培養(yǎng) 本研究計劃取得中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。在患者知情同意的前提下，24例成人骨髓均取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科退變性腰椎滑脫、椎管狹窄伴腰椎不穩(wěn)、腰椎間盤突出伴退變性腰椎滑脫手術(shù)患者髂骨取骨區(qū)（2008年11月～2009年 5月，年齡38～73歲，平均61.3歲），排除血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及乙肝表面抗原陽性患者，2 mmol/L EDTA-PBS溶液抗凝。PBS等倍稀釋骨髓后，將骨髓按4:3比例加至于淋巴細胞分離液上，20℃2 000 r/min離心30 min。離心后，用吸管吸出中間單個核細胞層，用2倍體積PBS洗滌，1 000 r/min室溫離心7 min。以3×106/cm2接種于25 μg/ml人FN包被的培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后換液，洗去非貼壁細胞，每3天換液。倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞生長情況。

1.2.2細胞增殖情況觀測 分離的原代細胞接種3d后進行第一次換液，從第4天起，用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，將貼壁細胞重新接種于96孔板中，加入WST-8，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀檢測OD值。每24小時檢測1次，連續(xù)10 d，觀察細胞增殖情況并繪制生長曲線。

1.2.3 細 胞的 染 色與 鑒 定 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I雙熒光染色：EPCs與 10 μ g/ml Dil-ac-LDL避光孵育4 h，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，加入FITC-UEA-I（15μg/ml）避光孵育1 h，PBS漂洗，晾干，熒光顯微鏡下觀察。隨機計數(shù)10個非重疊視野，計算雙陽性細胞比例。

1.2.4細胞表型檢測 流式細胞術(shù)：0.25%胰酶消化EPCs，計數(shù)，分別與CD133、CD34、VEGFR-2、VE-cadherin、E-selectin、vWF單克隆抗體在4℃孵育30 min，用PBS漂洗，300 μl PBS懸浮細胞后上機檢測。

1.2.5透射電鏡分析 將EPCs輕輕刮下，2 000 r/ min室溫離心10 min，戊二醛固定30 min，離心，送透射電鏡室進行脫水、包埋、切片、染色。

1.2.6管腔形成實驗 將試劑盒中的膠液與緩沖液預(yù)混，鋪于板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，1× 104個細胞/孔接種于體外血管生成試劑盒的ECMatrix上，培養(yǎng)箱孵育過夜，12 h后倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)觀察和增殖情況

細胞接種時呈小圓形，24 h后可見細胞貼壁生長，并逐漸變?yōu)樗笮?，不貼壁細胞仍呈圓形，體積較小；4天左右細胞明顯增殖，細胞體積增大，5天左右見類似血島結(jié)構(gòu)的細胞集落形成，集落邊緣細胞呈紡錘形和不規(guī)則梭形，呈放射狀單層生長，集落中心細胞密集呈多層生長，5～6天時梭性細胞首尾相連接形成線樣結(jié)構(gòu)，少量細胞連接，呈明顯的管壁管腔，管壁由單層細胞組成；至第7天，細胞集落逐漸增大，細胞體積變大（圖1A）；約至第10天，細胞可達到80%～90%融合，細胞集落結(jié)構(gòu)消失，細胞伸展呈紡錘形（圖1B）；至第14天，細胞基本鋪滿瓶底，呈鋪路石樣密集排列（圖1C）。原代細胞在接種后第3天進行首次換液，第4～13天的細胞生長曲線顯示（圖2），從細胞原代分離時算起，第4～7天為EPCs增殖潛伏期，此期細胞緩慢增殖，生長曲線平緩，EPCs生長至第8～11天達到增殖高峰。

2.2內(nèi)皮祖細胞的熒光雙染實驗

采用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I染色，于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)合FITC-UEA-I的貼壁細胞呈綠色（圖1D），攝取Dil-ac-LDL的貼壁細胞呈紅色（圖1E），雙陽性標記細胞呈黃色（圖1F），陽性率為（95.1±4.0）%，表明其具有EPCs的特征。

2.3內(nèi)皮祖細胞的表型檢測

流式細胞儀分析培養(yǎng)7 d和14 d的細胞表達CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF的陽性率結(jié)果見表1及圖3，經(jīng)一定時間的誘導(dǎo)，CD133表達率下降，而相應(yīng)成熟ECs抗原KDR、E-selectin、vWF表達則增加（P＜0.05）。

圖2 EPCs生長曲線

圖3 培養(yǎng)7 d、14 d的細胞流式細胞儀分析結(jié)果：細胞表達CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF的陽性率

2.4 透射電鏡分析

透射電鏡結(jié)果顯示培養(yǎng)第10天的EPCs在細胞質(zhì)內(nèi)含一種短棒狀小體，含平行管狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即血管ECs所特有的Weibel-Palade小體（圖4）。

2.5體外血管生成實驗

培養(yǎng)第8天和第15天的原代細胞消化后種植于體外血管生成試劑盒的ECMatrix上，前者12 h可見細胞相互連接形成管腔樣結(jié)構(gòu)（圖1G），18 h可見原管腔增大，旁邊有新管腔形成，而后者12 h的管腔形成能力明顯弱于前者（圖1H）。

3 討論

1997年，Asahara等[2]等首次從外周血中分離出EPCs，隨后大量研究證實，這些細胞來源于骨髓，具有旺盛的增殖能力，能夠直接分化為血管ECs，在缺血等因素的刺激下，能夠動員人血，在受損血管的修復(fù)和缺血組織的再血管化中扮演著重要角色。

椎間盤是體內(nèi)最大的無血供組織，對退變腰椎間盤的病理學(xué)及MRI影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤退變過程中軟骨終板下骨血運改變是誘發(fā)退變的早期機制，而對退變腰椎間盤動物模型的軟骨終板形態(tài)學(xué)研究證明，軟骨終板血供減少、鈣化導(dǎo)致的腰椎間盤營養(yǎng)障礙，可能是啟動腰椎間盤退變的關(guān)鍵因素[8]。體外擴增的EPCs可整合至血管壁，促進缺血組織的血管新生及損傷血管內(nèi)膜的再內(nèi)皮化過程[7,9]。通過移植自體EPCs或動員骨髓中EPCs，可快速恢復(fù)血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能[10]。骨髓來源的EPCs可能對腰椎間盤退變病人終板下骨微循環(huán)的重建具有重要作用，為椎間盤退變性疾病的防治提供了新的思路。

細胞的誘導(dǎo)分化是多種細胞、細胞因子以及微環(huán)境相互調(diào)控作用的結(jié)果，在一個更接近人體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)條件下，更有利于EPCs的誘導(dǎo)分化。Murohara等[6]在體外培養(yǎng)臍血源性EPCs時發(fā)現(xiàn)，CD34－與CD34+細胞共同培養(yǎng)較CD34+細胞單獨培養(yǎng)貼壁細胞數(shù)量增加3倍，細胞集落數(shù)增加6倍，提示EPCs的發(fā)育可能需要CD34+細胞與CD34－細胞之間的相互作用。因此，本實驗24例骨髓標本均采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞，有利于EPCs和其他細胞的相互作用，促進EPCs生長。

在本研究的細胞培養(yǎng)過程中，棄去培養(yǎng)72h后的未貼壁細胞，可以避免骨髓中巨噬細胞、成纖維細胞等對實驗的干擾。培養(yǎng)至第7天，細胞集落逐漸增大，細胞體積變大，此時的培養(yǎng)細胞表達EPCs特異性抗原標志，可特異性攝取FITC-UEA-I并內(nèi)吞Dil-ac-LDL；最后細胞分化成典型成熟ECs的鋪路石樣形態(tài)，數(shù)量也明顯增加，這說明人骨髓單個核細胞在體外一定條件下可以分化為EPCs，且較成熟ECs有明顯的增殖優(yōu)勢。

本實驗應(yīng)用流式細胞儀，分析單個核細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化前后細胞表面表達內(nèi)皮系抗原的變化，在定向誘導(dǎo)分化早期，EPCs表面高表達CD133，隨時間推移表達比例逐漸下降，與此同時，相應(yīng)成熟的ECs抗原VE-cadherin、KDR、vWF的表達則顯著增加，表明EPCs在特定細胞因子的誘導(dǎo)下，逐漸失去幼稚細胞的特有標記物CD133，開始向成熟ECs分化。另一方面也體現(xiàn)出EPCs的不穩(wěn)定性。在老年及一些病理情況下，由于端粒酶活性降低，EPCs在體外培養(yǎng)時往往因為迅速老化而難以保持祖細胞性狀，表現(xiàn)為再生能力下降，倍增次數(shù)減少，凋亡加速等。

圖4 電鏡下觀察胞漿內(nèi)W-P小體(×39 000)

表1 EPCs不同時間點CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF表達結(jié)果（±s）

表1 EPCs不同時間點CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF表達結(jié)果（±s）

7 d 14 d t值P值CD133 18.5±4.4 3.8±4.7 3.224 0.034 CD34 45.4±7.8 36.1±2.3 1.312 0.235 KDR 66.7±7.2 81.8±6.4 2.901 0.045 VE-Cadherin 20.5±5.3 26.4±4.3 0.966 0.398 E-selectin 7.8±1.3 46.4±8.3 3.480 0.016 Vwf 5.4±1.0 38.9±6.2 5.898 0.001

實驗中，透射電鏡觀察到培養(yǎng)10 d的細胞胞漿中已出現(xiàn)典型的Weibel-Palade小體，表明EPCs已開始向成熟ECs分化。而通過對比不同時期EPCs的管腔形成能力，可以看出成熟ECs的成血管能力要遠遠弱于分化早期的EPCs。

總之，我們通過系統(tǒng)的檢測，確定了采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的人髂骨骨髓來源的單個核細胞，通過特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPCs，EPCs純度較高。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，為研究EPCs在椎間盤退變性疾病的發(fā)病機理奠定了基礎(chǔ)。

1 Isner JM,Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization [J]. J Clin Invest,1999,103(9):1231-1236.

2 Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997, 275(5302):964-967.

3 Maeda M,Fukui A,Nakamura T,et al.Progenitor endothelial progenitor cells on vascular grafts:An ultrastructural study[J]. J Bio Mater Res,2000,51(1):55-60.

4 Gill M,Dias S,Hattori K,et al.Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2+AC133+endothelial precursor cells[J].Circ Res,2001,88(2):167-174.

5 Rafii S,Oz MC,Seldomridge JA,et al.Characterization of hematopoietic cells arising on the textured surface of left ventricular assist devices[J].Ann Thorac Surg,1995,60(6): 1627-1632.

6 Murohara T,Ikeda H,Duan J,et al.Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,2000,105(11):1527-1536.

7 Kawamoto A,Tkebuchava T,Yamaguchi JI,et al.Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeautic neovascularization of myocardial ischemia[J]. Circulation,2003,107(3):461-468.

8 Jünger S,Gantenbein-Ritter B,Lezuo P,et al.Effect of limited nutrition on in situ intervertebral disc cells under simulatedphysiological loading.Spine,2009,34(12):1264-1271.

9 Murayama T,Tepper OM,Silver M,et al.Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo [J].Exp Hematol,2002,30(8):967-972.

10 Rafii S,Meeus S,Dias S,et al.Contribution of marrowderived progenitors to vascular and cardiac regeneration[J]. Semin Cell Dev Biol,2002,13(1):61-67.

（本文編輯 白朝暉）

Cultivation and identification of endothelial progenitor cells from human bone marrow

TANG Yu-bo*,CHEN Xiao,HUANG Bao-ding,FENG Xin,PENG Long-yun,PENG Xin-sheng,ZOU Xue-nong.*Department of Pharmacy,the First Hospital Affiliated of SUN Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,China Corresponding author:ZOU Xue-nong,E-mail：zxnong@hotmail.com

Objective To establish methods of isolation,cultivation,induction and identification for endothelial progenitor cells(EPCs)from human bone marrow in vitro.Methods Mononuclear cells were collected by density gradient centrifugation from the bone marrow of 24 patients with intervertebral disc degeneration.The isolated cells were cultivated in dishes coated with fibronectin and induced by angiogenic growth factors. Immuno-fluorescence staining and flow cytometry were used to indentify EPCs.The differentiation of EPCs to endothelial cells(ECs)was determined by transmission electron microscope(TEM)and in vitro angiogenesis. Results Cell colony-forming units appeared 72 hours after seeding and increased obviously after 5 days.One week later the cells confluenced to 80%.Attached cells formed cobblestone like structure by 14 days.The uptake rate of Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I was（95.1±4.0）%.Flow cytometric analysis showed that positive rate of CD133,CD34,KDR,and VE-Cadherin was（18.5±4.4）%,（45.4±7.8）%,（66.7±7.2）%,and（20.5±5.3）%, respectively.Weibel-Palade body was observed in endochylema under TEM.The cells cultivated for 7 days to 12 days formed tube-like structure on ECMatrix.Conclusions EPCs could be efficiently isolated by density gradient centrifugation combined with induction by EGM-2 medium from human bone marrow.EPCs had angiogenic potential between 7 days to 12 days.

Endothelial cells;Bone marrow cells;Cells,cultured;Cell separation

R329.2

A

1674-666X(2009)01-0056-06

“中-德生物技術(shù)青年科學(xué)家小組”計劃（國科生便子［2009］004號）；NSFC-廣東聯(lián)合基金（u0732001）

510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部（唐欲博、李孝），脊柱外科（黃保丁、彭新生、鄒學(xué)農(nóng)），心血管內(nèi)科（彭龍云）；中山大學(xué)藥學(xué)院（馮鑫）

鄒學(xué)農(nóng)，E-mail：zxnong@hotmail.com