摘要：對沉淀劑的體積比、沉淀劑與溶血液的體積比和沉淀時間對羊血紅蛋白去除效果的影響進行了研究，確定了最優(yōu)工藝參數(shù)。采用中心試驗組合設計和響應面分析法，得出的最優(yōu)組合為A₂B₂C₂，即沉淀劑為95％的乙醇與丙酮、沉淀劑與溶血液，體積比均為1:1，沉淀時間為30min。除血紅蛋白是羊血超氧化物歧化酶(Superoxide Dis-mutase，SOD)提取的關(guān)鍵，用響應面法工藝除羊血紅蛋白后得到的SOD粗酶液，活性為302.59U/mg。

關(guān)鍵詞：羊血；SOD；沉淀劑；提??；響應面法

中圖分類號：Q814.1

文獻標志碼：A

超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，S0D)是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，具有廣泛的醫(yī)用價值，可作為藥品、食品及日用化工產(chǎn)品的添加劑。目前工業(yè)生產(chǎn)中從血液中提取SOD采用的是氯仿、乙醇作提取有機溶劑。但是，氯仿對機體有極大毒害，可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具麻醉作用，可引起肝腎損害。除血紅蛋白是羊血SOD提取的關(guān)鍵，本研究探討以丙酮代替氯仿提取SOD的效果。重點研究沉淀劑的體積比、沉淀劑與溶血液的體積比、沉淀時間對羊血紅蛋白去除效果的影響，采用響應面分析法確定最優(yōu)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊血采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山清真牛羊產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司。鄰苯三酚：天津市化學試劑三廠生產(chǎn)。三羥基氨基甲烷：上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。乙二胺四乙酸：廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)。氯化鈉、檸檬酸三鈉等為分析純。無水乙醇、丙酮、氯仿等為化學純。對照樣品為牛血清白蛋白。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)。uV 2000紫外分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)。TGL-166臺式離心機：上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)。PHS0828 pH計：成都全速科技有限公司生產(chǎn)。9003恒溫雙向磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。SZ-97自動三重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)?？烧{(diào)式移液器：上海儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定 在試管中按表1加入緩沖液和雙蒸水，于25℃恒溫20min后加入25℃預熱過的鄰苯三酚，迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325nm處每30s測定1次吸光值A_325nm對照管用濃度為10mmol/L的鹽酸代替。試劑l為雙蒸水。試劑2是濃度為100mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液。試劑3是濃度為45mmol/L的鄰苯酚溶液。試劑4是濃度為10mmol/L的鹽酸。

1.3.2 SOD活性的測定 SOD活性的測定方法按表1操作，加入鄰苯三酚前，先加入一定量的SOD，并減少同體積雙蒸水，其他操作均與1.3.1相同，所測吸光度為B_325nm。

通過測定鄰苯三酚的自氧化反應速度(△A_325nm/min)和SOD抑制下的自氧化速度(△B_325nm/min)，便可算出SOD活力?；盍挝欢x為：25℃，1mL反應液中每1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達50％時的酶量定為一個活力單位(U)。

單位體積酶活力(U/mL)=(抑制率/50％)×

反應液總體積×(酶樣品液稀釋倍數(shù)/酶樣品液體積)，

抑制率=(△A_325nm/min-△B_325nm/min)×

100％/(△A_325nm·min^-1)，

比活力(U/mg)=單位體積酶活力/單位體積蛋白質(zhì)量分數(shù)=總活力/總蛋白。

1.3.3 蛋白質(zhì)量分數(shù)檢測 考馬斯亮藍法以牛血清白蛋白作為標準。

1.3.4 溶血液的制備 新鮮羊血與0.38％檸檬酸三鈉體積比為1:7的溶液，攪拌均勻，以4 000r/min的速度離心20min，除去黃色血漿，收集紅血球。紅血球加入等體積去離子水，4℃條件下攪拌30min，4℃冰箱過夜。

1.3.5 篩選優(yōu)化沉淀劑 在考察沉淀劑的基礎上選取沉淀劑的體積比、沉淀劑與溶血液的體積比、沉淀時間進行中心組合試驗結(jié)合響應面分析。以SOD活力為衡量指標。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同試劑對羊血紅蛋白去除效果的影響

試劑1為95％的乙醇與氯仿體積比是0.25:0.15(常用提取SOD方法)；試劑2為丙酮；試劑3為95％的乙醇與丙酮，體積比是0.25:0.15。

各取50mL溶血液分別按提取劑與溶血液的體積比1:1加入試劑1，2，3，攪拌15min，靜置30min，4 000r/min離心20min，上清液即為粗酶提取液。室溫25℃條件下測活，平行測定3次，取平均值，測試結(jié)果見表2。

由表2可知，常用提取方法得到SOD粗酶活力為310U./mag，而當提取劑為95％的乙醇與丙酮，體積比為0.25:0.15，取樣時測活力為287U/mg，雖比標準方法單位活力小，但有繼續(xù)研究的價值。故確定可以用體積分數(shù)為95％的乙醇：丙酮為沉淀劑繼續(xù)探索。

2.2 沉淀劑對SOD活性的影響

用95％的乙醇與丙酮體積比為1:1做沉淀劑，各取50mL溶血液分別按沉淀劑與溶血液的體積比為3:5，4:5，1:1，5:4，5:3，攪拌15min，靜置30min，4 000r/min離心20min，上清液即為粗酶提取液。室溫25℃條件下測活，平行測定3次取平均值，測試結(jié)果見表3。

由表3可知，當沉淀劑是體積分數(shù)為95％的乙醇：丙酮且體積比為1:1時，SOD粗酶液活性最大，為356.41U/mg。

2.3 沉淀劑與溶血液體積比對SOD活性的影響

各取50mL溶血液分別按沉淀劑與溶血液的體積比為2:5，3:4，1:1，4:3，5:2，加入95％的乙醇與丙酮的體積比為1:1的沉淀劑，攪拌15min，靜置30min，4 000r/min離心20min，上清液即為粗酶提取液。室溫25℃條件下測活，平行測定3次取平均值，測試結(jié)果見表4。

由表4可知當沉淀劑與溶血液的體積比為1:1時SOD粗酶液活性最大，為349.34U/mg。

2.4 沉淀時間對SOD活性的影響

各取50mL溶血液，按沉淀劑與溶血液的體積比為1:1加入95％的乙醇與丙酮，攪拌15min，分別靜置10，20，30，40，50min，4 000r/min離心20min，上清液即為粗酶提取液。室溫25℃條件下測活，平行測定3次取平均值，測試結(jié)果見表5。

由表5可知，當沉淀時間為30min時SOD粗酶液活性最大，為352.80U/mg。

2.5 最優(yōu)工藝參數(shù)

建立95％的乙醇與丙酮體積比為1:1，沉淀劑與溶血液體積比為1:1，沉淀時間3因素3水平的試驗設計方案，其因素水平見表6。同時，以中心試驗組合設計原則進行試驗，結(jié)果見表7。每組試驗取溶血液50mL，以SOD活力為衡量指標。

由DPS(Data Processing System)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件將試驗結(jié)果做二次多項式逐步回歸進行響應面分析，同時擬合得出回歸方程：

Y302.003 333 307.621 250 000*X₁+

5.745 000 000*X₂+3.426 250 000*X₃-

32.121 666 67X₁*X₁-

39.119 166 67X₂*X₂-

45.351 666 67X₃*X₃+

30.587 500 000X₁*X₂-

4.355 000 000X₁*X₃+

11.452 500 000X₂*X₂。

根據(jù)進一步分析得出方程F值=6.420 4，相關(guān)系數(shù)R=0.959 35，顯著水平P=0.027 2，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.881 48，剩余標準差S=18.611 70。

因為R＞Ra，Y回歸效果都顯著。Y的二次項和交互項都是顯著的。因此，各因素和指標之間的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。最終由回歸方程得出最高指標時的各個因素組合：Y=302.592 23；X₁=-0.102 69；X₂=0.040 28；X₃=0.047 79，即95％的乙醇與丙酮，體積比為1:1，沉淀劑與溶血液的體積比為1:1，沉淀時間為30min，在此條件下除血紅蛋白后SOD粗酶液的活性為302.59U/mg蛋白。

Y的等值線和響應面圖見圖1，圖2和圖3。

3 結(jié)論

除血紅蛋白是羊血SOD提取的關(guān)鍵。響應面優(yōu)化試驗最佳工藝組合為：A₂B₂C₂，即95％的乙醇與丙酮體積比為1:1，沉淀劑與溶血液的體積比為1:1，沉淀時間為30min，通過該工藝純化的SOD活性為302.59U/mg蛋白。

(責任編輯、校對 武曉蘭)