吳劍秋， 張莉莉， 馬大偉

乳腺癌特異基因(breast cancer specific gene 1,BCSG1)又名SNCG(γ-synuclein gene)，是1997年用cDNA 直接測序法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關基因[1-4]。已有的研究表明BCSG1在正常乳腺組織中低表達, 在乳腺癌組織中高表達，在乳腺癌的預后判斷和抗腫瘤藥物篩選中有重要作用[ 5-8]。Pan等[9-12]首先報道 BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)在基因的表達調控中發(fā)揮重要作用，其在正常乳腺組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，而在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高去甲基化狀態(tài)，同時其異常去甲基化是其在乳腺癌中異常高表達的重要機制之一。但DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響，在不同種族人群中，同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉錄調控中的作用可能存在較大差異[13-16]。關于中國人群乳腺癌患者中BCSG1甲基化與乳腺癌的關系，目前尚無定論。本研究擬通過一定樣本量的觀察，探討在中國人群乳腺癌患者中，BCSG1甲基化在乳腺癌發(fā)病及良性增生或纖維腺瘤中的作用。探討位于BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關系以及BCSG1甲基化作為乳腺癌分子標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究材料

江蘇省腫瘤醫(yī)院2007—2008年經(jīng)手術切除的具有完整臨床病理資料的乳腺組織標本，獲取新鮮標本后迅速凍存于液氮，然后轉入-70℃冰箱中保存。其中乳腺癌及對應的癌旁組織82例，良性病變組織78例。82例乳腺癌患者，年齡28～75歲，平均年齡56.7歲。其中浸潤性導管癌75例，浸潤性小葉癌2例，其他5例。

1.2 研究方法

1.2.1 組織標本的基因組DNA 采用組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA(德國Qiagen)。具體操作按試劑盒說明書進行。 DNA/RNA微量定量儀測定所提基因組DNA濃度及OD260/OD280。

1.2.2 基因組DNA亞硫酸氫鹽修飾 采用DNA Cp G島甲基化修飾試劑盒(Cp Genome DNA Modification Kit，Chemicon公司，S7820)對DNA樣品進行亞硫酸氫鈉修飾。具體操作按試劑盒說明書進行。取1.0 μg DNA 樣品溶于100 μL H2O 中，加入7.0 μL 3M NaOH，50℃溫育10 min。加入550 μL新鮮配制的DNA 修飾試劑Ⅰ，振搖后于50℃避光溫育4～16 h。然后進行脫鹽、去磺基、二次脫鹽，最后用25 μL的TE緩沖液將DNA 洗脫下來。

1.2.3 PCR擴增 設計兩對引物，去甲基化特異性引物簡稱為U(unmethylation)，甲基化特異性引物簡稱為M(methylation)。見表1。

表1 BCSG1基因甲基化特異PCR引物序列

每個PCR反應體積為25 μL，內含：1.5 mmol/L的MgCl2，200 μmol/L的dNTPs，200 nmol/L的引物，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA樣品1 μL。PCR反應條件：95℃ 15 min，95℃ 40秒，52℃或60℃ 40秒，72℃40秒，共40個循環(huán)，最后72℃ 10 min。

1.2.4 PCR產物分析 取8 μL PCR產物于2.0%的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳約30 min。于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。

1.2.5 甲基化狀態(tài)判定標準 每個樣本都用兩對引物(U和M)進行MSP擴增，同批修飾處理的基因組CG位點全去甲基化和全甲基化的DNA(Chemicon公司)，分別作為去甲基化和甲基化引物的陽性對照，二者分別只能由去甲基化引物和甲基化引物擴增出相應大小的條帶；陰性對照采用加ddH2O而不加模板的PCR體系，見圖1。若該基因發(fā)生了甲基化，則用甲基化特異性引物可擴增出相應大小的條帶，用M表示；若為去甲基化，則用去甲基化特異性引物可擴增出相應大小的條帶，用U表示；若該基因發(fā)生了部分甲基化，則甲基化和去甲基化特異性引物均可擴增出相應大小的條帶。見圖2。

圖1 MSP檢測BCSG1甲基化狀態(tài)的對照體系；U-DNA：基因組CG位點全去甲基化DNA；M-DNA：基因組CG位點全甲基化DNA；U：去甲基化特異性引物；M：甲基化特異性引物

圖2 MSP檢測石蠟包埋乳腺組織BCSG1甲基化狀態(tài)

1.2.6 PCR產物測序 為驗證MSP的特異性，隨機選取PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 應用EpiInfo 6軟件，采用兩樣本率的χ2檢驗或者Fisher′s確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中BCSG1甲基化狀態(tài)檢測結果

本組研究中所有組織標本中均檢測到去甲基化狀態(tài)的存在，其中在82例乳腺癌和相應癌旁組織中分別有27例(32.9%)和15例(18.3%)檢測到純合性去甲基化，78例乳腺良性病變組織25例(32.1%)檢測到純合性去甲基化；82例乳腺癌和相應癌旁組織分別有55例(67.1%)和67例(81.7%)檢測到甲基化，78例乳腺良性病變組織53例(67.9%)檢測到甲基化，均為雜合型甲基化；BCSG1的完全去甲基化狀態(tài)在乳腺癌旁組織與癌組織(χ2=4.61，P<0.05)、癌旁組織與良性病變組織間(χ2=4.04，P<0.05)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2～4。

表2 各種乳腺組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

表3 乳腺癌組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

表4 乳腺良性病變組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

2.2 BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌臨床病理特征的關系

統(tǒng)計結果顯示，BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者年齡，腫瘤大小，淋巴結轉移狀況，組織學類型，病理分級之間的差異均無統(tǒng)計學意義。見表5。

表5 BCSG1甲基化狀態(tài)與臨床資料間的關系

3 討論

BCSG1第一外顯子區(qū)域的CpG島的甲基化狀態(tài)是影響其轉錄的主要機制之一，而BCSG1甲基化則有可能成為乳腺癌的標志物。然而，DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響，在不同種族人群中，同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉錄調控中的作用可能存在較大差異。Gupta等[12-16]的研究就表明，GSTP1，CD44和E-Cadherin等基因的甲基化狀態(tài)在不同種族人群中存在較大差異。本文研究了乳腺癌患者BCSG1甲基化及其與臨床資料的關系并得到如下結果：(1)乳腺癌、癌旁組織以及乳腺良性病變組織中BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)均存在去甲基化；(2)其甲基化狀態(tài)與臨床指標之間無顯著關聯(lián)。已有報道顯示[8]，乳腺癌組織中BCSG1的甲基化頻率比乳腺癌旁組織和良性病變組織低，而我們的研究結果顯示，不僅在癌旁組織，良性病變組織中BCSG1的甲基化頻率亦低于乳腺癌旁組織,提示BCSG1的去甲基化在腫瘤發(fā)生進程中所起的作用。與國外報道[11-12]不同 ，在中國人群正常組織中，我們也檢測到BCSG1的去甲基化狀態(tài)，這一結果提示我們將甲基化狀態(tài)用作腫瘤標志物時需考慮遺傳背景及種族間的差異。

綜上所述，我們的結果顯示在中國人群乳腺癌患者中，BCSG1具有獨特的甲基化狀態(tài)和表達模式，這一結果提示BCSG1的甲基化狀態(tài)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用可能因種族和遺傳背景的不同而不同。而BCSG1是否能用作乳腺癌輔助診斷和預后判斷的分子標志物還需要在不同種族、不同遺傳背景的人群中進行大規(guī)模樣本的研究。

[1] Ji H, Liu YE, Jia T, et al. Identification of a breast cancer-specific gene, BCSG1, by direct differential cDNA sequencing[J]. Cancer Res，1997,57(4): 759-764.

[2] Lavedan C, Leroy E, Dehejia A, et al.Identification, localization and characterization of the human γ-synuclein gene[J]. Hum Genet，1998, 103(1): 106-112.

[3] Ninkina NN, Alimova-Kost MV, Paterson JWE, et al.Organization, expression and polymorphism of the human persyn gene[J]. Hum Mol Genet，1998, 7(9): 1417-1424.

[4] Clayton DF, George JM.The synucleins: a family of proteins involved in synaptic function, plasticity, neurodegeneration and disease[J]. Trends Neurosci, 1998, 21(6): 249-254.

[5] Bruening W, Giasson BI, Klein-Szanto AJ, et al. Synucleins are expressed in the majority of breast and ovarian carcinomas and in preneoplastic lesions of the ovary[J]. Cancer, 2000,88(9): 2154-2163.

[6] Wu K, Quan Z, Weng Z,et al.Expression of neuronal protein synuclein gamma gene as a novel marker for breast cancer prognosis[J]. Breast Cancer Res Treat, 2007, 101(3): 259-267.

[7] Jia T, Liu YE, Liu J, Shi YE. Stimulation of breast cancer invasion and metastasis by synuclein γ[J]. Cancer Res, 1999,59(3): 742-747.

[8] Liu J, Spence MJ, Zhang YL, et al. Transcriptional suppression of synuclein γ(SNCG) expression in human breast cancer cells by the growth inhibitory cytokine oncostatin M[J]. Breast Cancer Res Treat，2000, 62(2): 99-107.

[9] Pan ZZ, Bruening W, Giasson BI, et al.γ-Synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways[J]. J Biol Chem, 2002, 277(38): 35050-35060.

[10] Inaba S, Li C, Shi YE,et al.Synuclein gamma inhibits the mitotic checkpoint function and promotes chromosomal instability of breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res Treat ,2005, 94(1): 25-35.

[11] Lu A, Gupta A, Li C, et al. Molecular mechanisms for aberrant expression of the human breast cancer specific gene 1 in breast cancer cells: control of transcription by DNA methylation and intronic sequences[J]. Oncogene, 2001, 20(37): 5173-5185.

[12] Gupta A, Godwin AK, Vanderveer L,et al. Hypomethylation of the synucleinγ gene CpG island promotes its aberrant expression in breast carcinoma and ovarian carcinoma[J]. Cancer Res ,2003, 63(3): 664-673.

[13] Ushijima T. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells[J]. Nature Reviews Cancer, 2005, 5(3): 223-231.

[14] Feinberg AP. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease[J]. Nature, 2007, 447(7143): 433-440.

[15] Enokida H, Shiina H, Urakami S, et al. Ethnic group-related differences in CpG hypermethylation of the GSTP1 gene promoter among African-American, Caucasian and Asian patients with prostate cancer[J]. Int J Cancer, 2005, 116(2): 174-181.

[16] Woodson K, Hayes R, Wideroff L, et al. Hypermethylation of GSTP1, CD44, and E-Cadherin genes in prostate cancer among US blacks and whites[J]. Prostate, 2003, 55(3): 199-205.