摘要：目的 觀察活血(三七總皂苷)、解毒(黃連提取物)、活血解毒中藥有效部位(虎杖提取物、大黃醇提物)對(duì)ApoE基固敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊炎癥反應(yīng)的影響。方法 70只(6～8)周齡小鼠ApoE基因敲除小鼠子高脂飲食喂養(yǎng)13周后，待其形成成熟的AS斑塊后，隨機(jī)分為活血解毒組(虎杖提取物組、大黃醇提物組)、活血對(duì)照組(三七總皂苷組)、解毒對(duì)照組(黃連提取物組)、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(辛伐他汀組)。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)并按體重比折算的臨床推薦劑量給予相應(yīng)藥物治療13周后，處死動(dòng)物，檢測(cè)血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及可溶性白細(xì)胞分化抗原40配體(sCINOL)水平，并取主動(dòng)脈根部4個(gè)切面，分別行HE染色和Movat染色，用免疫組化染色法觀察小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-r)的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)PPAR-r及核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，大黃醇提物組及虎杖提取物組血清hs-CRP和sCD40L水平均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。解毒對(duì)照組黃連提取物主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR-r蛋白及基因表達(dá)均明顯增多(P＜0.01)，而中藥各組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)NF-Kb d3mRNA的表達(dá)與模型組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 采用臨床推薦劑量治療的活血解毒中藥有效部位中，虎杖提取物和大黃醇提物可明顯降低ApoE基因敲除小鼠血清炎癥標(biāo)志物hs-CRP及sCD40L水平，其效果優(yōu)于單純活血或解毒組，但對(duì)PPAR-r和NF-kB的作用并不明顯。而黃連提取物卻可明顯增加具有抗AS炎癥作用的保護(hù)性受體PPAR-r的蛋白和基因表達(dá)，提示其作用環(huán)節(jié)有所不同，值得深入研究。

關(guān)鍵詞：易損斑塊；活血；解毒；動(dòng)脈粥樣硬化；炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R543.5 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-1349(2007)12-1202-04

Ross動(dòng)脈粥樣硬化(AS)炎癥假說認(rèn)為，炎癥反應(yīng)貫穿于AS起始、進(jìn)展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是斑塊不穩(wěn)定發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)。抑制炎癥反應(yīng)，防止斑塊破裂現(xiàn)已成為該領(lǐng)域的重要研究方向。既往的研究結(jié)果表明活血中藥酒大黃具有良好的穩(wěn)定易損斑塊作用，效果優(yōu)于其他常用活血中藥組，其機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，由于大黃兼有活血和解毒作用，現(xiàn)代藥理研究表明清熱解毒中藥多具有抗炎的類效應(yīng)，而抑制炎癥反應(yīng)又是穩(wěn)定易損斑塊的重要機(jī)制，為此，提出了“活血解毒—抑制炎癥反應(yīng)—穩(wěn)定斑塊”的假說，并在此基礎(chǔ)上，深入研究活血、解毒、活血解每中藥有效部位三七總皂苷、黃連提取物、虎杖提取物、大黃醇提物對(duì)ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 (6～8)周齡ApoE基因敲除小鼠(品系C57BL/6J，北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育)70只，均為雄性，體重18g～20g，飼以含脂肪21％、膽固醇0.15％的高脂飼料(60Cor滅菌照射處理)，飼養(yǎng)條件為2級(jí)，室溫保持在22℃～24℃，相對(duì)濕度50％，光照時(shí)間07:00～19:00。

1．2 藥物 虎杖提取物由湖南省洪江華光生物有限責(zé)任公司提供，批號(hào)：20050601；大黃醇提物及黃連提取物均由西安奧晶科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào)分別為050841、050910；血塞通片(三七總皂苷)由云南特安吶制藥股份有限公司提供，批號(hào)為050118；辛伐他汀(商品名舒降之)，由杭州默沙東制藥有限公司出品。批號(hào)為P1196，

1．3 試劑與儀器 小鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和可溶性白細(xì)胞分化抗原40配體(sCD40L)ELISA試劑盒購(gòu)于RB公司(進(jìn)口分裝)；一抗小鼠來(lái)源單克隆抗體過氧化物酶體增殖物激活受體r(PPAR-r)由Sant Cruz公司提供；二抗為通用型二抗，購(gòu)自Sant Cruz公司；cDNA合成試劑盒和熒光定量RCR試劑盒均由TaKaRa公司提供；PPAR-R及核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)的上下游引物均由Invitrogen公司提供；全自動(dòng)生化測(cè)定儀型號(hào)：RX-2000，美國(guó)TECHNICON公司生產(chǎn)；gemeAmpPCR Systerne 9700由美國(guó)ABI公司提供；定量PCR儀型號(hào)Rotor gene-3000A，芬蘭基因公司提供；美國(guó)Image-ProPlus Version 5.0(IPP)圖像分析軟件。

1．4 分組及給藥方法 小鼠喂養(yǎng)13周后，隨機(jī)處死4只，取主動(dòng)脈根部，HE染色普通光鏡下觀察，確定AS形成后，其余小鼠隨機(jī)分為6組：辛伐他汀組、虎杖提取物組、大黃醇提物組、黃連提取物組、模型組及三七總皂苷組各11只。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用量：虎杖提取物組0.25s/kg，大黃醇提物組、黃連提取物組均為0.1g/ks，三七總皂苷組0.005g/kg，辛伐他汀組0.0001g/ks。按體重系數(shù)比折算成小鼠用量：虎杖提取物組2252。5 m#M，大黃醇提物組、黃連提取物組均為901mg/kg，三七總皂苷組45.05mg/kg，辛伐他汀組9.01mg/kg。藥物溶于蒸餾水，灌胃給藥，每日1次，繼續(xù)喂養(yǎng)13周。取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存，用作測(cè)定血清ks-CRP和sCD40 L濃度。處死全部小鼠，無(wú)菌條件下取出心臟及主動(dòng)脈，心臟10％甲醛固定，主動(dòng)脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷，-80℃保存。

1．5 檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法

1．5．1 特殊病理染色 改良的Movat五色套染法參考文獻(xiàn)[7]并略加改進(jìn)，最終的染色結(jié)果為：細(xì)胞核及彈力纖維為黑色；基質(zhì)和黏蛋白為藍(lán)色；膠原纖維為黃色；平滑肌為紅色；泡沫細(xì)胞為淡紫色。

1．5．2 血清炎癥標(biāo)志物測(cè)定 采用雙抗夾心ELISA法對(duì)小鼠血清ks-CRP和sCD40 L進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1．5．3 免疫組織化學(xué)染色 小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片，每隔50/μn連續(xù)取6張切片，切片厚5μm。按Suzuki等確立的方法，每只小鼠的主動(dòng)脈根部取4個(gè)相同的切面，分別為：①升主動(dòng)脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；②主動(dòng)脈辦附著部位，并有冠狀動(dòng)脈開口；③主動(dòng)脈辦起始橫截面；④主動(dòng)脈辦完全出現(xiàn)并匯合在一起。分別進(jìn)行病理HE和Movat染色。免疫組化染色選取第三切面，采用兩步法測(cè)定斑塊內(nèi)PPAR-r蛋白表達(dá)(抗體稀釋度為1:200)，每組均以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，在100倍鏡下海張切片選取5個(gè)不同的視野，對(duì)陽(yáng)性區(qū)域累積面積進(jìn)行定量測(cè)定，最后求取斑塊內(nèi)陽(yáng)性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

1．5．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 先提取總RNA，然后取4μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物等反應(yīng)物混合配成20μL體系，42℃15min，95℃，2min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，小鼠NF-kB引物序列：forward 5，-GGAG-GCATGTTAGTGG-3，reverse 5，-CCCTG CGTTGGATTTCGTG-3，擴(kuò)增片段105bp；小鼠PPAR-r引物序列：forward 5，-TGTCG GTTCAGAAGTGCC TG-3，reverse5，-TTCAG CTGGTC GATAT CACTGGAG-3，擴(kuò)增片段122bp；擴(kuò)增條件是95℃10s，95℃5s，60℃34s，共40個(gè)循環(huán)。以小鼠肌動(dòng)蛋白β－actin為內(nèi)參照，引物序列為：forward 5’－CAGAA GGAGATT AC TGCn：IGGCT-3’reverse 5’-GGAGCCAC CGATCCACACA-3’，擴(kuò)增片段93 bp。最后與模型組比較得出相對(duì)濃度值。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素分析各組差異。

2 結(jié) 果

2．1 對(duì)模型組動(dòng)脈硬化斑塊的觀察 高脂飲食喂養(yǎng)26周后，HE染色顯示小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膽固醇酯及膽固醇結(jié)晶增多，纖維帽菲薄，表面有大量的泡沫細(xì)胞覆蓋，呈現(xiàn)易損斑塊特征。Movat染色顯示斑塊內(nèi)細(xì)胞外脂質(zhì)成分較多，膠原成分較少，血管中膜結(jié)構(gòu)萎縮、變薄。

2．2 各組小鼠血清炎癥標(biāo)志物比較 給藥13周后，人黃醇提物組、虎杖提取物組及辛伐他汀組血清hs-CRP水平較模型組顯著降低(P＜0.01)，大黃醇提物組及虎杖提取物組血清sCD40L水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，三七總皂苷組和黃連提取物組血清hs-CRP和sCD40L水平與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。大黃醇提物組、虎杖提取物組血清hs-CRP和sCD40L水平的降低與三七總皂苷組或黃連提取物組比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

2．3 給藥后各組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR－r蛋白表達(dá)的改變

與模型組比較，給藥13周后黃連提取物組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR－r蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，其余各給藥組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR-r蛋白表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖1、圖2。

2．4 給藥后各組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR-r mRNA和NF-kBmRNA表達(dá)的改變 與模型組相比，給藥13周后黃連提取物組可明顯增加主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR-rmRNA的表達(dá)(P＜0.01)，其余給藥組PPAR ymRNA的表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)汁學(xué)意義(P＞0.05)。而各給藥組中只有辛伐他汀組可明顯降低NF-kBmRNA的表達(dá)(P＜0.01)。

3 討 論

研究表明，決定斑塊穩(wěn)定性的主要因素——脂質(zhì)核心的大小、纖維帽的厚度及其修復(fù)能力等與AS炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。炎癥引起斑塊不穩(wěn)定的機(jī)制主要表現(xiàn)在幾個(gè)方面：①炎癥細(xì)胞可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)的沉積。脂蛋白和炎癥反應(yīng)相互作用，形成惡性循環(huán)，從而使斑塊趨于不穩(wěn)定；②炎癥細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、干擾素等炎性介質(zhì)，相互作用后可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、削弱纖維帽，或抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，降低其修復(fù)能力，從而使斑塊不穩(wěn)定；③炎癥反應(yīng)還可以促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生，新生血管破裂出血可導(dǎo)致斑塊易損。

CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是機(jī)體非特異炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物之一。多項(xiàng)研究顯示，ks-CRP作為目前最可靠的AS炎癥標(biāo)志物，與斑塊的進(jìn)展密切相關(guān)，現(xiàn)已被視為急性冠脈綜合征(ACS)發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并用于判定其預(yù)后。CD40-CD40L途徑幾乎貫穿AS發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂的全過程。研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定型心絞痛病人相比，不穩(wěn)定型心絞痛病人外周血sCD40L水平明顯增高。sCD40L與ACS密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)給藥13周后大黃醇提物組、虎杖提取物組血清ks-CRP和sCD40L水平與模型組比較均顯著降低，活血解毒中藥有效部位組表現(xiàn)出較好的降低AS斑塊血清炎癥標(biāo)記物的作用，明顯優(yōu)于單純活血或解毒組。并且所表現(xiàn)出的趨勢(shì)與各藥物組對(duì)易損斑塊穩(wěn)定性的改善大致相同，從而也驗(yàn)證了先前提出的“活血解毒—抑制炎癥反應(yīng)—穩(wěn)定斑塊”這一假說。

活化的PPAR-r通過活化蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(VXQx)信號(hào)通路能抑制多種與斑塊進(jìn)展相關(guān)促炎癥因子、黏附分子的基因表達(dá)，抑制1L-6、環(huán)氧化酶、內(nèi)皮素-1、一氧化氮合酶的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)以及減少基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生，最終起到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊的作用。而NF-KB的激活引起前炎癥因子的表達(dá)是AS發(fā)生與發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。研究表明NF-KB的激活是斑塊破裂的敏感標(biāo)志物之一。本研究結(jié)果表明，給藥13周后黃連提取物可明顯上調(diào)主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPAR-r蛋白及基因表達(dá)，但各中藥組均不能明顯降低NF-KB mRNA的基因表達(dá)。因此，推測(cè)黃連提取物可能通過增加抗AS炎癥的PPAR-r受體的表達(dá)而起到穩(wěn)定易損斑塊的作用，這在國(guó)內(nèi)未見其他報(bào)道。

目前，清熱解毒中藥已成為治療冠心病的常用中藥。臨床應(yīng)用的一些清熱解毒藥如黃連解毒湯、清熱解毒方等除了抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)外，還具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，并對(duì)高血脂、內(nèi)毒素等各種原因?qū)е碌难軆?nèi)皮損傷有保護(hù)作用。這些機(jī)制均能干預(yù)冠狀A(yù)S的發(fā)展進(jìn)程。而PPAR-r受體可通過抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗血栓形成、促進(jìn)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)膠原代謝等多種途徑去干預(yù)易損AS斑塊。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè)PPAR-r受體可能有望成為清熱解毒中藥抗AS和穩(wěn)定易損斑塊的潛在作用靶點(diǎn)，值得深入研究。

本研究提示，抑制炎癥反應(yīng)為活血、解毒類中藥，尤其是具有解毒作用中藥(含單純解毒和活血解毒中藥)穩(wěn)定易損斑塊的作用機(jī)制之一。綜上所述，采用臨床推薦劑量的活血解毒中藥有效部位中，虎杖提取物和大黃醇提物可明顯降低ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈血清炎癥標(biāo)志物ks-CRP及sCD40L水平，優(yōu)于單純活血或解毒中藥有效部位三七總皂苷和黃連提取物組，但對(duì)PPAR-r，NF-kB上游炎癥相關(guān)因子作用并不明顯。而解毒中藥有效部位黃連提取物可明顯增加抗動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的保護(hù)性受體PPAR-r的蛋白和基因表達(dá)，提示其作用環(huán)節(jié)有所不同，值得深入研究。

作者簡(jiǎn)介：周明學(xué)，現(xiàn)為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院2005級(jí)博士研究生(郵編：100700)；徐浩(通訊作者)、溫見燕、潘琳，工作于中日友好醫(yī)院(郵編：100029)；陳可冀，工作于中日友好醫(yī)院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)