摘要：目的 構(gòu)建攜帶白細胞介素－6(IL-6)基因的腺病毒載體Ad－IL6，在大鼠腦缺血模型中觀察外源基因IL-6的表達對腦缺血損傷的影響。方法 RT-PCR擴增人IL-6cDNA序列，構(gòu)建攜帶IL-6基因的腺病毒載體，在293細胞中重組腺病毒Ad-IL6；通過夾閉雙側(cè)頸總動脈合并低血壓以減少腦血流量，制備急性腦缺血大鼠模型；分別在術(shù)前、術(shù)后尾靜脈注射Ad-IL6，觀察大鼠神經(jīng)癥狀，進行神經(jīng)功能評分和腦組織病理觀察。結(jié)果 以健康成年人血液單個核細胞成功擴增出IL-6 cDNA序列，并在293細胞中重組出腺病毒Ad-IL6；以1×10⁹pfu/200μL的病毒劑量治療，術(shù)前治療組、術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組大鼠的神經(jīng)癥狀評分較假手術(shù)組高，腦組織出現(xiàn)病理損傷；術(shù)前治療組大鼠的神經(jīng)癥狀評分較術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組低，腦組織病理損傷輕；而術(shù)后治療組評分略高于手術(shù)無治療組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 IL-6對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性及神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護雙重作用。損傷前IL-6的正?；蚋咚奖磉_狀態(tài)對隨后的神經(jīng)損傷可起到一定保護作用，但在體內(nèi)神經(jīng)損傷激活了免疫反應(yīng)后增加IL-6的表達，則起到加重損傷的負面效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：白細胞介素-6；腺病毒；神經(jīng)損傷；神經(jīng)保護；大鼠

中圖分類號：R743 R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1214-03

白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)是由巨噬細胞、單核細胞、T細胞、B細胞等多種細胞分泌的一種多肽物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，可作用于多種靶細胞，除參與機體的炎癥反應(yīng)和抗感染防御機制外，還與自身免疫疾病密切相關(guān)。研究表明，IL-6在腦血管病的發(fā)病過程中起重要作用。國外通過轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過度表達IL-6的實驗，發(fā)現(xiàn)IL-6可引起神經(jīng)元的退行性變，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病。但也有實驗證明，IL-6可通過刺激星形膠質(zhì)細胞的活化增殖及合成神經(jīng)營養(yǎng)因子而發(fā)揮神經(jīng)保護功能，其本身也具有神經(jīng)營養(yǎng)因子的類似作用，可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化生長，發(fā)揮促神經(jīng)修復(fù)作用。鑒于IL-6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷過程中的作用尚未完全闡明，還存在著互相矛盾的結(jié)果，有必要進行更深入的研究。本項研究克隆IL-6基因，構(gòu)建攜帶IL-6基因的腺病毒載體Ad-116，同時建立急性腦缺血損傷大鼠動物模型，在大鼠腦缺血損傷發(fā)生的前后，給予Ad-IL6灌注，繼而觀察外源基因IL-6的表達對腦缺血損傷轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的影響。力求闡明IL-6在心腦血管疾病的作用和意義。

1 材料與方法

1．1 材料來源 腺病毒載體質(zhì)粒購自Microbix Biosystem公司，內(nèi)切酶購自NEB公司，293細胞系來源于中科院上海細胞所，Wistar大鼠來源于中科院上海動物所，Ltipo Factamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)永POR試劑盒為LifeTechnologies產(chǎn)品。引物由上海申能博彩生物公司合成。

1．2 攜帶IL－6的腺病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)GeneBankBC015511的基因序列，合成IL－6 cDNA引物，由上海博彩生物公司合成。上游引物：5’－cgg aat tcg CCC agc tat gaa ctc ctt ctcCaC-3'，下游引物：5’-gcg teg act gec ot get aca tn gcc gaa gag-3’。上下游引物引入EcoRI和SalI位點。

取健康成年人血6 mL，分離單個核細胞，采用TrlxD試劑提取總RNA。以總1LNA2μg為模板，RT-PCR擴增人IL-6cDNA序列，擴增片段大小671bp?；厥諗U增產(chǎn)物，EcoRI+San酶切后，插入T載體，送上海申能博彩生物公司測序。

經(jīng)測序證實后，EcoRI+SalI酶切T載體，回收661bp的酶切片段，插入到腺病毒載體pDC315中，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后，與pBHGIoxddEl3ere一同轉(zhuǎn)染293細胞，具體方法參見轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書。共轉(zhuǎn)染后12 d出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過空斑純化，得到重組腺病毒Ad-IL6。采用IL-6 cDNA特異性引物進行腺病毒的鑒定。

1．3 構(gòu)建動物模型 參考文獻[6]方法制備大鼠腦缺血模型。雄性Wistar大鼠20只，體重300g±50g，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.75g/kg)。取仰臥位，無菌條件下分離兩側(cè)頸總動脈并分別置線備用。麻醉術(shù)中及術(shù)后清醒前，用烤燈維持動物體溫在37.0℃±0.5℃。實驗分4組，術(shù)前治療組、術(shù)后治療組、手術(shù)無治療組和假手術(shù)組，每組5只。術(shù)前治療組、術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組，用動脈夾通過夾閉雙側(cè)頸總動脈60 min合并低血壓以減少腦血流量，造成急性腦缺血。假手術(shù)組只進行兩側(cè)頸總動脈分離并分別置線，而不做動脈夾閉。

1．4 動物模型治療及觀察 術(shù)前治療組和術(shù)后治療組大鼠分別在手術(shù)前3h和手術(shù)后1h時進行重組腺病毒Ad－IL6注射，采用尾靜脈注射，每只給予1×10⁹pfu/200μL的病毒劑量。術(shù)后24h內(nèi)每6h觀察記錄1次大鼠神經(jīng)癥狀，按0分～4分標(biāo)準(zhǔn)評分，記錄分值。

1．5 腦組織病理觀察 術(shù)后24h將大鼠斷頭取腦，10％中性甲醛溶液固定腦組織12h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色觀察腦組織病理形態(tài)的改變。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2．1 重組腺病毒的鑒定 采用IL-6 cDNA特異性引物，對重組腺病毒Ad-II，6進行PCR鑒定，擴增出IL-6 cDNA序列，擴增片段大小671bp。證實腺病毒Ad-IL6重組成功。詳見圖1。

2．2 動物模型評分 實驗中20只大鼠成功制作模型18只，術(shù)前治療組和術(shù)后治療組各有1只大鼠在手術(shù)中死亡。術(shù)前治療組、術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組大鼠的神經(jīng)癥狀評分較假手術(shù)組高(P＜0.001)，顯示大鼠腦缺血模型建立成功；術(shù)前治療組大鼠的神經(jīng)癥狀評分較術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組低(P＜0.05)，顯示術(shù)前IL-6表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用；而術(shù)后治療組評分略高于手術(shù)無治療組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示術(shù)后增加IL-6表達有可能加重神經(jīng)損傷。每組中各時間點之間比較，經(jīng)過手術(shù)的腦缺血模型組大鼠的神經(jīng)癥狀評分，有隨時間進展而增高的趨勢，在18h，24h的評分高于6h的評分(P＜0.05)，而假手術(shù)組則在各個時間點的評分沒有差別。詳見表1。

2．3 腦組織病理改變 假手術(shù)組大鼠的腦組織神經(jīng)細胞胞膜清晰完整，無變形、水腫，核仁清晰可見。而其他組的大鼠腦組織病變區(qū)域呈現(xiàn)不同程度的間質(zhì)疏松、神經(jīng)細胞腫脹明顯、間質(zhì)水腫，細胞及血管周圍間隙增大，術(shù)前治療組略輕，術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組更為明顯。

3 討 論

已有的免疫學(xué)研究表明，IL-6等白細胞介素是促進多種急性炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)或是免疫調(diào)節(jié)因子。包括急性腦血管病在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病過程，都可以檢測到細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)等的含量明顯升高。但對這些細胞因子含量變化的生物學(xué)意義，還存在爭論，特別是IL-6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷過程中的作用機制尚未完全闡明。

IL-6等炎癥介質(zhì)加重腦組織損傷的機制，可能是多方面的。如可促使中性粒細胞釋放活性氧和彈性蛋白酶，對血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞造成直接的損傷，加重腦組織水腫及神經(jīng)細胞的壞死或凋亡；促進血小板激活因子、凝血因子Ⅷ等多種組織因子的釋放；促進凝血過程及血管舒縮功能紊亂，引發(fā)血栓發(fā)生；增加自由基等神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。但是也有學(xué)者對此有不同看法，認為IL-6是一種腦缺血后神經(jīng)細胞死亡的內(nèi)生拮抗劑，可起到神經(jīng)保護作用。有實驗證明，IL-6具有神經(jīng)營養(yǎng)因子的類似作用，可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化生長，發(fā)揮促神經(jīng)修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死血清IL-6表達水平升高的病人，臨床療效明顯優(yōu)于IL-6水平低的病人，提示IL-6在急性腦梗死病人腦損傷修復(fù)過程中起神經(jīng)保護及神經(jīng)營養(yǎng)作用。

本項研究表明，IL-6發(fā)揮神經(jīng)損傷作用還是神經(jīng)保護作用，與其本身表達的時相有很大關(guān)系。術(shù)前治療組大鼠的神經(jīng)癥狀評分較術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組低，并且該組的病理切片顯示腦組織水腫也比術(shù)后治療組和手術(shù)無治療組輕微，說明在術(shù)前給予外源性IL-6基因并誘導(dǎo)其表達，具有明顯的神經(jīng)損傷保護作用。術(shù)后治療組評分略高于手術(shù)無治療組，顯示術(shù)后給予外源性IL-6表達不但沒有神經(jīng)保護作用，而且有可能加重神經(jīng)損傷。缺血大鼠模型的神經(jīng)損傷在24h內(nèi)有隨時間進展而加重的趨勢。實驗表明，IL-6對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性及神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護雙重作用。損傷前IL-6的正?；蚋咚奖磉_狀態(tài)對隨后的神經(jīng)損傷可起到一定保護作用，但在神經(jīng)損傷發(fā)生后，體內(nèi)激活了免疫反應(yīng)，此時增加IL-6的表達，則起到加重損傷的負面效應(yīng)。因此，進一步研究IL-6作用機制，并通過各種方法使他們發(fā)揮神經(jīng)元保護作用而拮抗其促炎效應(yīng)，可能是今后治療腦缺血的一條新的有效途徑。

作者簡介：巽筱倩(1967—)，女，畢業(yè)于徐州醫(yī)學(xué)院，副主任醫(yī)師。剮教授，現(xiàn)工作于江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院(郵編：224001)；蘇長青，工作于上海東方肝膽外科醫(yī)院。

(本文編輯 王雅沾)