摘要：目的 觀察活血降糖膠膠囊對2型糖尿病(T2DM)大鼠并發(fā)主動(dòng)脈粥樣硬化血管壁核因子-Kb(NF-kB)表達(dá)水平的調(diào)控作用。方法 選1月齡SD大鼠45只，隨機(jī)取8只為空白組(灌服等量蒸餾水)，其余為實(shí)驗(yàn)組，成模大鼠隨機(jī)分為中藥組[灌服活血降糖膠囊懸浮液1.44g/(kg·d)和模型組(灌服等量蒸餾水)。每天灌胃1次，連續(xù)治療30d后，取主動(dòng)脈做常規(guī)石蠟切片，免疫組化觀察其核因子-kB(NF-kB)表達(dá)的程度。結(jié)果 模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)典型粥樣硬化病變，活血降糖膠囊中藥組動(dòng)脈膜受損程度有所減輕。模型組主動(dòng)脈血管壁NF-kB表達(dá)明顯增加，活血降糖膠囊中藥組均可降低其主動(dòng)脈NF-kB表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論活血降糖膠囊可降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈壁NF-kB表達(dá)的作用，發(fā)揮對抗血管壁的炎性損傷作用。

關(guān)鍵詞：活血降糖膠囊；核因子kB；動(dòng)脈粥樣硬化

中圖分類號：Rj43.1 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1208-02

糖尿病引起動(dòng)脈粥樣硬化(atherosderosis，AS)的機(jī)制是多方面的，單高血糖而言，形成不可逆的糖化蛋白、糖化脂蛋白、糖基化終產(chǎn)物(AGE)等大分子物質(zhì)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，增加炎癥因子的表達(dá)，增加氧化損害的程度，引起血管組織結(jié)構(gòu)和功能的損害，而促使AS形成。隨著炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的不斷檢出，AS不再被認(rèn)為是單純動(dòng)脈壁脂質(zhì)堆積的疾病，而是進(jìn)展性炎癥反應(yīng)。在AS的啟動(dòng)、病變之進(jìn)展及晚期并發(fā)癥中炎癥始終起中心作用。研究表明炎癥反應(yīng)過程涉及了機(jī)體多種基因，而這些基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子存在一個(gè)或多個(gè)kB序列，其活化前提是核因子kB(nuclearfactorkappaB，NF-kB)的激活。在形成AS的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，NF-kB的活化是一個(gè)中心環(huán)節(jié)，可與相關(guān)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子特殊KB序列相結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生長與凋亡等方面發(fā)揮重要作用。通過制作實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病(T2DM)大鼠AS模型，利用免疫組織化學(xué)方法觀察活血降糖膠囊對AS大鼠主動(dòng)脈NF-kB表達(dá)及血管壁形態(tài)的影響，進(jìn)一步探討活血降糖膠囊的抗AS作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 藥物與試劑 活血降糖膠囊(主要為血竭、丹參、太子參等組成)，由廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號：Z030222531；STZ和枸櫞酸均購自廣州威佳科技有限公司；血糖儀及其試紙購自O(shè)neToucH^TM強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司；NF-xBD65濃縮型多克隆抗體(效價(jià)1:100)購自武漢博士德生物工程公司；二步法Supervision試劑盒及DAB顯色試劑購自上海長島生物工程有限公司。

1．2 動(dòng)物與飼料 SPF級1月齡雄性SD大鼠45只，體重140g～160g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物合格證號：SCXK(粵)2003-0001。SPF級基礎(chǔ)飼料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室提供。高脂高糖飼料由基礎(chǔ)飼料加入煉豬油15％、白糖20％、雞蛋5％、膽固醇1％、食鹽0.1％。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及給藥方法 參考黃霖等造模方法，均自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后隨機(jī)抽取8只作為空白組，喂以基礎(chǔ)飼料；其余的喂高脂、高糖飼料共6周并注射2％鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg，然后將大鼠隨機(jī)分為中藥組[灌服活血降糖膠囊1.44g，(k8·d)]、空白組和模型組(以相當(dāng)劑量蒸餾水灌服)。每天灌胃1次，連續(xù)30d后，取主動(dòng)脈常規(guī)石蠟切片做HE染色，Weiger彈力纖維染色；免疫組化法觀察NF-kBp65的表達(dá)程度。

1．4 光鏡、電鏡標(biāo)本的制備 取主動(dòng)脈血管長約1cm，生理鹽水沖洗，予10％的中性甲醛溶液中固定2h～4h，逐級酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，Weigert彈力纖維染色以乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下攝片。

1．5 NF-kBp65的免疫組化結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色均采用兩步法，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。用O1ympus顯微鏡觀察，陽性表現(xiàn)為胞核、細(xì)胞質(zhì)黃染，無黃染者為陰性細(xì)胞。計(jì)算機(jī)圖像分析儀測定陽性產(chǎn)物的光密度，每張切片選取5個(gè)高倍視野計(jì)算平均值。每組切片選取5葉視野，共計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占400個(gè)細(xì)胞百分比。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，由SPSS 11.5軟件對配對資料進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 活血降糖膠囊對大鼠AS病變影響的光鏡觀察

2．1．1 HE染色 空白組：主動(dòng)脈形態(tài)正常，內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，無脂質(zhì)條紋或纖維斑塊，內(nèi)膜完整，無炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)彈力膜完整，無斷裂。模型組：主動(dòng)脈內(nèi)膜斷裂，泡沫細(xì)胞增多，散在炎細(xì)胞浸潤，中層平滑肌增生且排列紊亂，脂質(zhì)沉積，斑塊形成，部分模型血管腔可見血栓形成。中藥組：內(nèi)皮細(xì)胞脫落可見有部分修復(fù)，脂質(zhì)沉積，范圍局限，散在少量泡沫細(xì)胞。

2．1．2 Weigert彈力纖維染色 空白組內(nèi)彈力膜完整，無增生；模型組內(nèi)膜顯示有多量增生纖維，多數(shù)內(nèi)彈力板分離、斷裂，甚至消失；中藥組內(nèi)膜增生不明顯，彈力板斷裂較模型組有所減少，部分拉伸變平。

2．2 NF-kB陽性表達(dá) 空白組血管壁見少量NF-kB陽性表達(dá)細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)有少量不均勻的黃褐色顆粒狀物；模型組血管胞核中表達(dá)NF-kB的細(xì)胞比例顯著高于空白組(P ＜0，01)，而中藥組血管壁中胞核陽性的細(xì)胞比例顯著低于模型組(P＜0，05)。各組NF-kB表達(dá)陽性率。詳見表1。

3 討 論

病理解剖顯示，糖尿病病人無論在冠狀動(dòng)脈還是腦動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、周圍動(dòng)脈都存在較同齡非糖尿病病人更為嚴(yán)重的AS。同時(shí)糖尿病病人因動(dòng)脈粥樣硬化性疾病引起的死亡占糖尿病總病死率的80％，較普通人群多。自Brand等首次采用p65mAb標(biāo)記技術(shù)證實(shí)在AS的形成過程中存在著NF-kB因子參與，多個(gè)研究證實(shí)在斑塊損害處的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中存在著NF-kB因子的廣泛活化，而在無損害的血管處卻極少發(fā)現(xiàn)。已證實(shí)NF-kB激活后可誘導(dǎo)參與調(diào)控與AS有關(guān)的基因包括：炎癥細(xì)胞因子(MCP)、急性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、免疫受體、生長因子(PDGF)、趨化因子、細(xì)胞黏附分子及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等多種物質(zhì)等。這些因子對細(xì)胞的活化、趨化、浸潤和增殖起調(diào)控作用。當(dāng)NF-kB刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)這些炎癥因子，可進(jìn)一步促進(jìn)VSMC的遷移和增殖，促進(jìn)AS的發(fā)展。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-kB的抑制劑IKKB-A，IKK-2nd可部分抑制白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)。從影響NF-kB出發(fā)深入探討其干預(yù)AS的作用及其機(jī)制，有可能成為AS中醫(yī)藥治療及其機(jī)制研究的新的切入點(diǎn)。

活血降糖膠囊以血蝎、三七、丹參活血化瘀；太子參補(bǔ)氣，石斛養(yǎng)陰潤燥；枸杞滋補(bǔ)肝腎，消補(bǔ)兩調(diào)，標(biāo)本兼治。已有研究表明，活血化瘀藥如丹參、血竭、三七具有降血脂、改善血液黏稠度、促進(jìn)血液循環(huán)、減少及延緩并發(fā)癥發(fā)生的作用；補(bǔ)氣藥太子參能提高血中胰島素含量，促進(jìn)胰島釋放胰島素，以降低血糖；石斛、枸杞等養(yǎng)陰藥具有良好的降糖、降脂作用。通過祛邪、扶正發(fā)揮減少高血糖，血脂紊亂對內(nèi)皮的直接損傷，從而達(dá)到治療AS的目的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：中藥組內(nèi)皮細(xì)胞脫落、脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤、平滑肌增生、排列紊亂及彈力板斷裂數(shù)量和范圍均較模型組減少，血管胞核中NF-kBp65表達(dá)胞核陽性的細(xì)胞比例顯著低于模型組(P＜0.05)，推測活血降糖膠囊對AS血管的保護(hù)作用可能通過其非降脂效應(yīng)即抑制，AS血管NF-kB的表達(dá)而發(fā)揮抗AS，為臨床防治AS的產(chǎn)生提供新的理論依據(jù)。

作者簡介：黃霖(1952—)，女，畢業(yè)于廣州醫(yī)學(xué)院，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，現(xiàn)工作于廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(郵編：510120)；李迎新，現(xiàn)為廣州醫(yī)學(xué)院2005級碩士研究生；劉華、陸冬曉、羅崇謙，工作于廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬院。

(本文編輯 郭懷印)