摘要：目的 觀察舒冠滴丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊CD40通路的調(diào)節(jié)作用。方法 運(yùn)用高脂高膽固醇飼料造成兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，隨機(jī)分成模型組、舒冠滴丸組、辛伐他汀組，另設(shè)空白對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性細(xì)胞間黏附分子－1(sICAM－1)和血管細(xì)胞黏附分子－1(sVCAM－1)濃度。然后，提取AS兔主動(dòng)脈和心臟進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果 舒冠滴丸組血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)水平顯著低于模型組(P＜0.01)，舒冠滴丸組血漿sCD40L，sICAM－1水平明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而血漿sVCAM－1水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病理組織形態(tài)學(xué)觀察，舒冠滴丸組主動(dòng)脈AS斑塊明顯少于模型組(P＜0.05)，冠狀動(dòng)脈AS斑塊各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)：舒冠滴丸組內(nèi)膜病變較模型組明顯減輕，其內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜／中膜厚度比、內(nèi)膜／中膜面積比亦較模型組顯著減少(P＜0.01)。結(jié)論 舒冠滴丸具有調(diào)節(jié)血脂紊亂，減少動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊數(shù)量，消退和穩(wěn)定AS斑塊，降低血漿sCD40L，sICAM－1水平，其作用可能與抑制AS斑塊炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：舒冠滴丸；動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞間黏附分子－1；細(xì)胞黏附分子－1：兔

中圖分類(lèi)號(hào)：R543.5 R285.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)10－0958－03

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥在不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊的發(fā)生、演變及破裂過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。CD40－CD40L作為重要的炎癥信號(hào)通路，它的主要生物學(xué)效應(yīng)之一是促進(jìn)炎癥介質(zhì)如血管黏附分子的釋放。細(xì)胞間黏附分子－1(ICAM－1)和血管細(xì)胞黏附分子－1(VCAM－1)表達(dá)增加可促進(jìn)AS的慢性炎癥過(guò)程，同時(shí)增加AS斑塊的不穩(wěn)定性，加快斑塊裂隙，促進(jìn)斑塊破裂、血栓形成。因此，檢測(cè)外周血可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性ICAM－1(sICAM－1)和可溶性VCAM－1(sVCAM－1)濃度可反映AS斑塊的炎癥程度和穩(wěn)定性狀況。舒冠滴丸是在古方心救湯(《石室秘錄》)基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的防治冠心病心絞痛的有效驗(yàn)方，是以冰片、鵝不食草、三七、白芥子、肉桂、公丁香、紅參等為主要組成部分，功能芳香通脈、益氣溫陽(yáng)、豁痰化瘀。本研究通過(guò)構(gòu)建兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察舒冠滴丸對(duì)AS斑塊CD40通路的調(diào)節(jié)作用，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康日本雄性大耳白兔44只，平均體重2.0 ks(1.9 ks～2.5kg)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：醫(yī)動(dòng)字第20～003號(hào)。飼養(yǎng)條件：?jiǎn)位\分裝，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度65％±5％，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20-001號(hào)。

1．2 實(shí)驗(yàn)藥物 舒冠滴丸每粒50 mg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院藥劑科提供，批號(hào)：20001030。舒降之片(辛伐他汀，每片20mg)，由默沙東制藥有限公司提供，批號(hào)：20020530。

1．3 主要試劑、儀器 膽固醇粉(分析純，每瓶25 g，荷蘭進(jìn)口上海試劑站分裝)，豬油(市售)，蛋黃粉(陜西天斗蛋業(yè)有限公司提供)；sCD40L試劑盒(奧地利Bender MedSysterns公司提供)sICAM－1，sVCAM－1試劑盒(法國(guó)DIACLONE公司提供)，L_D－A5型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn))，CL－7200全自動(dòng)生化分析儀(日本島津公司)，721分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠制造)，TP－1000電子天平(湘儀天平儀器廠生產(chǎn))，DG－3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(國(guó)營(yíng)華東電子管制造廠制造)。

1．4 兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及分組 將44只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成4組：空白組(8只)、模型組(12只)、舒冠滴丸組(12只)、辛伐他汀組(12只)。以上各組除空白組只給予標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料外，其余各組均每天每只給予高脂飼料100 g(含1.0 g膽固醇、7.5 g蛋黃粉、5.0 g豬油、86.5 g標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料)喂養(yǎng)8周，8周后隨機(jī)抽取高脂飼料喂養(yǎng)兔2只處死，取胸主動(dòng)脈標(biāo)本制作病理切片以證實(shí)產(chǎn)生粥樣硬化斑塊。動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功后，舒冠滴丸組每只每日按人一兔等效量給藥[50mg/(kg·d)]，辛伐他汀組每只每日喂服辛伐他汀藥液[2.5mg/(kg·d)]，空白組、模型組灌飼蒸餾水10 mL，每組均給藥4周，均于上午給食前灌胃。所有動(dòng)物自由飲水，繼續(xù)喂養(yǎng)4周。最終取得完整資料者進(jìn)入分析，共28只，其中舒冠滴丸組7只。辛伐他汀組7只，模型組6只，空白對(duì)照組8只。

1．5 指標(biāo)檢測(cè)方法

1．5．1 標(biāo)本處理 各組均于12周后分別從兔頸動(dòng)脈收集血樣(5～6)mL，注入10 mL肝素抗凝離心管，搖勻，3 500 r/min離心3 min，取上清血漿置于－70℃保存待測(cè)sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1。同時(shí)測(cè)定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)。

1．5．2 血漿sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿sCD40L，其檢測(cè)靈敏度為0.095ng/mL。采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿sICAM－1和sVCAM－1，其靈敏度分別為0.1 ng/mL和0.6 ng/mL，批內(nèi)和批間誤差分別在1.03％～2.82％，3.93％～8.15％(sICAM－1)和0.45％～2.27％，0.144％～5.94％(sVCAM－1)。

1．5．3 血脂檢測(cè) TC和TG采用酶法測(cè)定。即通過(guò)特殊氧化酶使底物生成過(guò)氧化氫，再通過(guò)氧化酶使它們結(jié)合成色原(生色團(tuán))，產(chǎn)生的顏色與分析物的量成正比，然后用比色法測(cè)定生色團(tuán)的生成量。HDL－C采用磷鎢沉淀法，磷鎢酸－Mg²⁺可選擇性沉淀LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)，上清液則為HDL。即在血清中分別加入MgCl₂和磷鎢酸液，充分混勻后離心，取上清液進(jìn)行HDL－C測(cè)定。當(dāng)濃度低于4.5 mmol/L時(shí)，VLDL中的膽固醇含量與血中TG濃度成完全線性關(guān)系。故可根據(jù)已知的HDL－C，TC和TG濃度計(jì)算出LDL－C濃度，即根據(jù)Friedewald公式[LDL－C(mmol/L)＝TC－HDL－C－TG/2.2]求得。

1．5．4 病理形態(tài)學(xué)觀察 12周末處死動(dòng)物，取其心臟和主動(dòng)脈大體標(biāo)本(從近主動(dòng)脈弓部到腹腔干分支處)，生理鹽水沖洗后沿正中線剪開(kāi)，鋪平，置于10％中性緩沖甲醛液中固定48 h，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，將其橫斷面制成4μm厚連續(xù)切片，經(jīng)HE染色，光鏡下觀察攝像。采用德國(guó)遠(yuǎn)東蔡司公司KS400圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)定斑塊面積及內(nèi)膜總面積，并計(jì)算斑塊/內(nèi)膜面積比；從HE染色片上隨機(jī)選取5個(gè)視野，圖像分析儀測(cè)定內(nèi)膜及中膜厚度、內(nèi)膜及中膜面積，并計(jì)算內(nèi)膜/中膜厚度比、內(nèi)膜/中膜面積比。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用One－way ANOVA檢驗(yàn)，用Bonferroni方法進(jìn)行兩兩比較，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 血管大體觀察結(jié)果提示，空白組內(nèi)膜光滑，未見(jiàn)指紋，無(wú)斑塊形成；舒冠滴丸組、辛伐他汀組和模型組均可見(jiàn)不同程度脂肪和粥樣斑塊隆起，模型組尤為明顯，斑塊連成片狀，從主動(dòng)脈近端到遠(yuǎn)端，斑塊逐漸減輕；舒冠滴丸組、辛伐他汀組斑塊明顯減少，除近端外，較少連成片狀，主要分布于血管分支處。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，舒冠滴丸組與模型組比較，主動(dòng)脈AS斑塊明顯少于模型組(P＜0.05)；與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。冠狀動(dòng)脈AS斑塊各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表1。

2．2 各組血漿sCD40L及血管黏附分子水平的變化 舒冠滴丸組、辛伐他汀組血漿sCD40L，slCAM－1水平明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；辛伐他汀組血漿sVCAM－1水平降低與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。

2．3 各組血脂水平變化情況 舒冠滴丸組、辛伐他汀組、模型組各項(xiàng)血脂水平高于正常范圍，且血清TC，TG，LDL－C水平顯著高于空白組(P＜0.01)。而舒冠滴丸組、辛伐他汀組血清TC，TG，LDL－C水平顯著低于模型組(P＜0.01)，HDL－C水平則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表3。

2．4 病理細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果 HE染色可見(jiàn)，空白組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞排列完整，中膜外膜分界清楚，無(wú)泡沫細(xì)胞堆積及斑塊形成；冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮完整、光滑，內(nèi)膜不增厚，管腔無(wú)狹窄。模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)皮不光滑不完整，斑塊隆起明顯，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞；冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，斑塊形成，管腔狹窄3/4。舒冠滴丸組和辛伐他汀組內(nèi)膜可見(jiàn)部分增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列較完整，其下有少量泡沫細(xì)胞堆積，有少許斑塊隆起，冠狀動(dòng)脈血管腔狹窄1/2。舒冠滴丸組、辛伐他汀組斑塊/內(nèi)膜面積比、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜／中膜厚度比、內(nèi)膜／中膜面積比模型組顯著減少(P＜0.01)，而舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表4。

3 討 論

冠心病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)是AS的形成。在AS斑塊形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮的破損和內(nèi)皮功能的減退，內(nèi)皮通透性增加，血脂含量增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和脂質(zhì)氧化、變性以及血小板激活、細(xì)胞壞死、基質(zhì)合成等發(fā)揮重要作用。

CD40L屬于腫瘤壞死因子超基因家族中的一員，CD40L以細(xì)胞膜結(jié)合或血液中游離狀態(tài)兩種形式存在，并與CD40結(jié)合產(chǎn)生一系列的炎性反應(yīng)，包括促進(jìn)黏附分子如血管黏附分子等物質(zhì)的產(chǎn)生。近來(lái)的研究還提示，CD40L可通過(guò)調(diào)節(jié)粥樣斑塊的金屬蛋白酶表達(dá)，從而影響斑塊的穩(wěn)定性。sICAM－1和sVCAM－1屬免疫球蛋白超家族分子，sICAM－1主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)白細(xì)胞上的配體CD11/CD18復(fù)合物特異性結(jié)合，介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附。最近的研究發(fā)現(xiàn)激活血小板上的CD40L可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的sVCAM－1、sICAM－1和E－選擇素的表達(dá)。Kotowicz等也發(fā)現(xiàn)，CD40L能顯著增加人體臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞sICAM－1和sVCAM－1的表達(dá)。血管性黏附分子表達(dá)的增加將進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性，損害斑塊表層纖維帽結(jié)構(gòu)，促進(jìn)斑塊破裂、血栓形成，從而導(dǎo)致急性冠脈綜合征的發(fā)生。

本研究通過(guò)構(gòu)建兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察舒冠滴丸對(duì)AS兔CD40通路的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明舒冠滴丸能顯著降低TC，TG，LDL水平，升高HDL，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，減少動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊數(shù)量，延緩AS的進(jìn)程，促進(jìn)AS病變消退作用，降低血漿sCINOL，sICAM－1水平，抑制斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，延緩AS的進(jìn)展，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定，可為臨床合理運(yùn)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本文編輯 郭懷印