摘要：目的 觀察加味丹參飲預(yù)處理對(duì)乳鼠缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用及對(duì)蛋白激酶C(PKC)的影響。方法 將培養(yǎng)72 h的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組，空白組正常培養(yǎng)；血清對(duì)照組加50％大鼠血清培養(yǎng)；含藥血清組加50％含加味丹參飲的藥物血清培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組予缺氧再給氧。缺氧預(yù)處理組、加味丹參飲預(yù)處理組先給予缺氧預(yù)處理和加味丹參飲預(yù)處理，24 h后再予缺氧再給氧。結(jié)果 加味丹參飲預(yù)處理24 h后可防止缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的降低，防止乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的升高(P＜0.01)，提高蛋白激酶C活性(P＜0.01)。結(jié)論 加味丹參飲預(yù)處理具有延遲保護(hù)作用，其機(jī)制與激發(fā)細(xì)胞內(nèi)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：加味丹參飲；預(yù)處理；延遲保護(hù)；心肌細(xì)胞；蛋白激酶C

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)10－0953－03

反復(fù)短暫缺血一再灌注以激發(fā)自身的適應(yīng)性反應(yīng)，使心肌對(duì)隨后發(fā)生的持續(xù)性缺血的耐受力提高稱為缺血預(yù)處理(IPC)。缺血預(yù)處理可防止心肌缺血再灌注損傷，具有良好的臨床應(yīng)用前景。IPC對(duì)心肌的保護(hù)作用分為早期保護(hù)作用(EPC)與延遲保護(hù)作用(DPC)。目前關(guān)于中藥復(fù)方延遲保護(hù)作用的研究較少。本研究觀察加味丹參飲預(yù)處理的延遲保護(hù)作用，并觀察其對(duì)蛋白激酶C(PKC)的影響，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動(dòng)物 出生72 h的Wistar大鼠30只，成年大鼠10只，體重(200±20)g，雌雄各半，均由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK桂2003～0003。

1．1．2 藥物 加味丹參飲由丹參20g、檀香6g、赤芍10g、川芎6g、當(dāng)歸6g、紅花6 g、生地12g等組成。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)干燥、稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至含生藥2g/mL。

1．1．3 儀器及試劑 凝膠成像分析系統(tǒng)(BIORAD公司)、U－2001紫外分光光度計(jì)(日立公司)、低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)、PepTag非放射性蛋白激酶試劑盒(Promega公司)、WIP組織細(xì)胞裂解液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、乳酸脫氫酶(LDH，南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶(CK，南京建成生物工程研究所)、DMEM(Gibeo公司)、胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)。

1．2 方 法

1．2．1 體外大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中新生大鼠心臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，將出生72 h的30只Wistar大鼠，無(wú)菌條件下剪取心室。剪下的心臟用PBS(磷酸緩沖液)洗滌后，剪去心房，將心室剪成1 mm³碎塊，用0.125％胰蛋白酶37℃水浴中消化10 min，棄上清，再加入胰蛋白酶液消化10min，將上清液及沉淀物分別處理。上清液移至另一無(wú)菌離心管中，加入PBS離心，棄上清液。重復(fù)(1～3)次，充分洗去胰蛋白酶。消化處理之后，將心肌細(xì)胞加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中制成細(xì)胞懸液。將沉淀組織塊再加胰蛋白酶消化，沉淀，其上清液重復(fù)前述步驟，反復(fù)消化(3～8)次，制成心肌細(xì)胞懸液。將所有細(xì)胞懸液移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中放置1.5 h，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞。收集未貼壁的細(xì)胞懸于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度為3×10⁶/mL，接種于25 cm²的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d更換培養(yǎng)液，取培養(yǎng)3d的細(xì)胞單層進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧(H/R)損傷實(shí)驗(yàn)法 參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》進(jìn)行。DMEM培養(yǎng)液用高純氮?dú)怙柡?0 min，使培養(yǎng)液氧分壓低于4.00 kPa(30 mmHg)。心肌細(xì)胞單層換用缺氧培養(yǎng)液后。培養(yǎng)液內(nèi)立即沖入氮?dú)?1L/min流量)30 s以驅(qū)除瓶?jī)?nèi)氧氣，然后塞緊瓶塞密閉培養(yǎng)。缺氧不同的時(shí)間后可造成心肌細(xì)胞不同程度的損害。按此方法造成心肌細(xì)胞缺氧，缺氧3h后換用正常DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1h，造成再給氧損傷。

1．2．3 藥物血清制備 參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)新技術(shù)與新方法》中方法。取10只Wistar大鼠按區(qū)組隨機(jī)法分為血清對(duì)照組和藥物血清組，分別制備對(duì)照血清和藥物血清。藥物血清組灌胃加味丹參飲藥液，劑量是根據(jù)成人每日臨床用量按人與動(dòng)物之間藥物劑量換算而成(利用mg/kg折算mg/m2轉(zhuǎn)換因子”進(jìn)行計(jì)算)，大鼠每日藥量為6.42 g/kg，每日2次，連續(xù)3d。血清對(duì)照組灌以等量生理鹽水。于最后1次給藥后1 h，無(wú)菌條件下，頸總動(dòng)脈取血，分離血清；56℃、30min滅活補(bǔ)體ψ0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4 分組及給藥 將培養(yǎng)3d的乳鼠心室肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)樣本?？瞻捉M：繼續(xù)培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h?？瞻籽鍖?duì)照組：培養(yǎng)液中加入50％大鼠血清培養(yǎng)24 h，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。含藥血清對(duì)照組：培養(yǎng)液中加入50％含加味丹參飲的藥物血清培養(yǎng)24 h，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。缺氧/復(fù)氧(H/R)組：繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后缺氧3 h，再給氧1 h。缺氧預(yù)處理(HPC)組：繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后缺氧30 min，復(fù)氧30 min，更換培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后缺氧3 h，再給氧1 h。加味丹參飲預(yù)處理組：給50％含加味丹參飲的藥物血清培養(yǎng)24 h，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后予缺氧3 h，再給氧1 h。

1．2．5 PKC的提取與測(cè)定 參照WIP組織細(xì)胞裂解液說(shuō)明書操作。每瓶細(xì)胞加入含PMSF的WIP裂解液(一般每次裂解5×10⁶1×10⁷細(xì)胞，每次用1 mL裂解液)，于冰上裂解30min。裂解完后，將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行)。于4 ℃下12 000 r/min離心5min。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中放于一20℃保存。

1．3 觀察指標(biāo)

1．3．1 細(xì)胞存活率、LDH及CK活性測(cè)定 以臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率，取培養(yǎng)細(xì)胞上清液以比色法測(cè)定LDH，CK活性。

1．3．2 PKC測(cè)定 具體操作按PepTag非放射性蛋白激酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。0.5 mL離心管中依次加入反應(yīng)緩沖液、PKC激活液、C1短肽，30℃預(yù)孵育2 min，加入樣品或?qū)φ?，使反?yīng)總體積為25μL。充分混勻，30℃孵育30 min后，離心管置于95℃水浴中10 min以終止反應(yīng)。每管加入85％的甘油1μL，充分混勻。0.8％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后取膠紫外燈下觀察照相。切下磷酸化條帶，盡量使其體積接近250 μL，將其放入一個(gè)1.5 mL帶有刻度的離心管中，95℃加熱至膠溶解。取175 μL熱瓊脂糖，與75 μL凝膠穩(wěn)定溶液、100 μL冰醋酸和150wL雙蒸水混勻。取500μL置于小杯中。570 nm比色，空白對(duì)照為液體瓊脂糖。根據(jù)Lamber－Beer定律：A＝εBC[式中：A為樣品的吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)(L/mol.com)，B為液層的厚度(比色皿的寬度)，C為PepTag C1短肽濃度(mol/L)]，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)，并以此求得各樣品中磷酸化C1肽含量。結(jié)果以u(píng)nits/mL表示(指每分鐘每毫升轉(zhuǎn)移到底物的mol磷酸的數(shù)量，即單位酶的活性)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，用四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2．1 各組PKC活性比較 含藥血清對(duì)照組、空白血清對(duì)照組PKC活性與空白組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。H/R組PKC活性最低，與其余各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0.01)。HP℃組、加味丹參飲預(yù)處NAft PKC活性最高(P＜0.01)。詳見表1。

2．2 各組細(xì)胞存活率、LDH及CK活性比較 H/R組細(xì)胞存活率、LDH及CK活性最低，與其余各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？瞻捉M、空白血清對(duì)照組、含藥血清對(duì)照組、H/R組、HPC組組間比較，細(xì)胞存活率、LDH及CK活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。2．3 各組電泳結(jié)果 加味丹參飲預(yù)處理組和HPC組PKC表達(dá)較其余各組高。

3 討 論

心肌預(yù)先反復(fù)短暫缺血后，可增強(qiáng)對(duì)后續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性，稱缺血預(yù)處理，是一種內(nèi)源性機(jī)體保護(hù)機(jī)制。缺血預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)作用分為兩個(gè)時(shí)期。EPK；于缺血預(yù)處理后即刻出現(xiàn)，(1～3)h逐漸消失，DPC于缺血預(yù)適應(yīng)后十幾小時(shí)開始出現(xiàn)，于24 h后達(dá)到高峰，往往持續(xù)(72～96)h。雖然EPC也有心臟保護(hù)作用，但其作用時(shí)間窗較窄，必須在缺血再灌注損傷前短時(shí)間內(nèi)給予，故臨床可操作性不強(qiáng)；相反，DPC作用時(shí)間跨度較大，在臨床運(yùn)用時(shí)更有可行性和便利性，因此更具實(shí)用價(jià)值和開發(fā)意義。缺血預(yù)處理是一種強(qiáng)有力的心肌保護(hù)因素，但它畢竟是一種損傷性的過(guò)程，且由于缺血吋最佳時(shí)間、安全時(shí)限及體質(zhì)差異等問(wèn)題使其臨床應(yīng)用受限制。因此，探討藥物預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)已成為研究的熱點(diǎn)之一。由于中藥效果明顯、毒副反應(yīng)較小等優(yōu)點(diǎn)，更具有良好的臨床應(yīng)用前景。

加味丹參飲在丹參飲基礎(chǔ)上化裁而成。因加味丹參飲主要用于治療缺血性心臟疾病，病位在心不在胃，故去原方之砂仁，加川芎、赤芍、當(dāng)歸等藥。前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究已表明，加味丹參飲對(duì)冠心病人有較好降脂作用，對(duì)家兔食餌性動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著的防治作用，并具有模擬缺血預(yù)處理樣的心肌保護(hù)作用。由于在細(xì)胞培養(yǎng)中缺氧/復(fù)氧更具有可操作性，且缺氧/復(fù)氧的效果與缺血再灌注相似，因此在細(xì)胞培養(yǎng)中常用缺氧/復(fù)氧模型來(lái)代替缺血再灌注。心肌缺血損傷時(shí)，細(xì)胞膜完整性受破壞，CK，LDH外漏。因此，檢測(cè)CK，LDH活性可反映心肌細(xì)胞受損程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，LDH、CK大量外漏，加味丹參飲預(yù)處理有延遲保護(hù)作用，能防止缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率降低，減少心肌細(xì)胞LDH，CK外漏。

PKC是一種Ca₂₊和磷脂依賴的蛋白激酶，已被廣泛認(rèn)同為IPC的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)過(guò)程中共同通路。內(nèi)源性生物活性物質(zhì)啟動(dòng)PKC的激活并轉(zhuǎn)位，是IPC；細(xì)胞保護(hù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，HPC組、加味丹參飲預(yù)處理組PKC明顯高于其他組(P＜0.01)。說(shuō)明加味丹參飲預(yù)處理可通過(guò)激活PKC的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮延遲保護(hù)作用。

本文編輯 郭懷印