摘要：目的 通過建立新西蘭家兔高脂血癥模型，探討肝臟低密度脂蛋白受體(LDL－R)基因水平與高脂血癥形成的關(guān)系。方法 建立高脂血癥家兔模型；觀察肝臟的病理改變；應(yīng)用原位雜交方法檢測肝臟低密度脂蛋白受體基因水平。結(jié)果 脂康可有效降低血脂水平，井能有效上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體基因水平。結(jié)論 脂康可激活肝臟細胞膜LDL－R基因表達，使LDL－R的活性增強，有效調(diào)節(jié)血脂水平，從而延緩改善動脈粥樣硬化的形成。

關(guān)鍵詞：高脂血癥；低密度脂蛋白受體；基因表達

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)10－0963－03

脂康由黃芪、沙棘、山楂、紅花、丹參、三七粉等組成，具有健脾益氣、祛痰降濁、活血化瘀之功效，適用于高脂血癥及輕中型冠心病，在臨床上取得了一定療效。脂康通過健脾益氣，調(diào)整陰陽氣血和臟腑功能，減少濁脂產(chǎn)生，清除人體內(nèi)的痰濁、瘀血等有害物質(zhì)，減少外源性脂質(zhì)的吸收，抑制脂質(zhì)合成，促進脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運和清除，影響脂質(zhì)的肝腸循環(huán)，加速脂質(zhì)排泄等多種途徑調(diào)節(jié)血脂。本實驗主要從基因水平研究脂康對高脂血癥家兔肝臟低密度脂蛋白受體基因表達的調(diào)節(jié)作用，從而探討脂康調(diào)節(jié)血脂的主要機制。

1 材料與方法

1．1 脂康方藥的制備 本處方由沙棘、山楂、丹參、紅花、黃芪、三七等為主組成。經(jīng)醇提、水提、干燥后制成丸劑，每丸0.5 g，每克含6 g生藥。

1．2 實驗動物造模及用藥方法 純種新西蘭大耳白兔60只，體重(1.9～2.1)kg，兔齡4個月，隨機選取10只為正常組，喂飼普通顆粒飼料，150 g/d，其余50只給予高脂飼料(1％膽固醇、5％蛋黃粉、5％豬油、89％普通飼料)喂飼，150 g/d。于第4周末根據(jù)膽固醇情況隨機分為5組，每組10只，模型對照組給予高脂飼料喂飼，150 g/d；其余用藥組除給予高脂飼料喂飼150g/d外，脂康低劑量組給予脂康浸膏0.2 g/(kg·d)；脂康高劑量組給予脂康浸膏0.4 g/(kg·d)；血脂康對照組給予血脂康0.18/(ks·d)；辛伐他汀對照組給予辛伐他汀0.8 mg/(kg·d)。家兔用藥劑量按人和動物體表面積換算，脂康低劑量或脂康高劑量相當于人60 kR每日的藥量。

喂飼8周后，麻醉，心臟取血，用于血脂項目檢測。取靠近肝門靜脈處的肝臟組織，直徑約2 cm，用濃度10％甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察。另取肝臟組織，直徑約1cm，用濃度4％多聚甲醛固定后做LDL－RmRNA(原位雜交)檢測。

1．3 生化指標檢測 分別于用藥前取耳緣靜脈血及用藥后心臟取血10 mL，離心3000 r/min，10 min，取血清分裝，－20℃冰箱保存，血清總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)含量測定采用酶法，根據(jù)Friedward公式法計算低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)，即LDL－C＝TC－(TC/2.2＋HDL－C)。動脈硬化指數(shù)(AlP)為TG與HDL－C摩爾濃度比值的對數(shù)。血脂檢測檢測試劑盒：北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)的試劑盒；LDLR ISH原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．4 肝臟組織LDL－R mRNA原位雜交檢測

1．4．1 實驗步驟 將新鮮的肝組織切成不超過4 mm的小塊，并及時用固定液固定1 h。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為(6～8)μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟，滴加H₂O₂室溫(5～10)min以滅活內(nèi)源性酶。暴露mRNA核酸片段：切片上加3％枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶。37℃，(12～15)min，清洗。固定，胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室溫固定10 min，清洗3次。預(yù)雜交，首先將濕盒準備好，每張切片滴加20 μL預(yù)雜交液，放人濕盒內(nèi)，(38～42)℃4 h，甩去多余的液體。雜交：在每張玻片上滴加20μL雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。放恒溫箱雜交過夜。雜交后洗滌。滴加封閉液：放入37℃30 min后取出，甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，放入37℃60 min，PBS洗滌。滴加SABC；放入37℃30 min，PBS洗滌。滴加生物素化過氧化物酶，37℃恒溫箱中放置30min，PBS洗滌。DAB顯色，使用DAB顯色試劑盒，滴至玻片上，顯色(30～50)min，充分水洗，蘇木精復(fù)染，充分水洗，酒精脫水，二甲苯透明，封固。

1．4．2 原位雜交實驗結(jié)果判定 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果的判定標準：原位雜交結(jié)果以細胞漿內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者或斑片為陽性細胞。

1．4．3 分析方法 計算機圖像分析，在圖像卡IBM586和OlympusBX60顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測定陽性細胞數(shù)：每組每只大鼠各5個高倍視野(10×40)下原位雜交陽性細胞率(％)。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料采用單因素方差分析(F檢驗)，結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示。用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2．1 血脂水平變化 本實驗結(jié)果提示脂康高劑量組對高脂血癥家兔血清TC，TG，LDL－C水平有顯著的降低作用(P＜0.01)，對HDL－C有顯著升高作用(P＜0.01)。脂康高劑量與西藥辛伐他汀對照組比較，在降低家兔血清TC，TG，LDL－C的作用相近，升高HDL－C作用優(yōu)于辛伐他??；與中藥血脂康比較，在降低家兔血清TC、LDL－C的作用明顯優(yōu)于血脂康，降低7G水平作用相近，升高HDL－C水平作用優(yōu)于血脂康。

2．2 肝臟病理學(xué)變化 正常對照組：肝細胞內(nèi)無大脂滴，只可見少量細小脂滴，無炎性細胞浸潤。模型對照組：彌漫性肝細胞脂肪變性，可見炎細胞浸潤，高倍鏡下可見細胞質(zhì)內(nèi)吞噬大量脂質(zhì)，呈空泡狀，核仁消失，大部分呈脂肪變性的肝細胞膜消失，相互融合，胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀。有的核仁被融合脂滴擠到一邊。有大量炎性細胞浸潤。各治療組：高倍鏡下可見脂滴，肝細胞呈空泡變性，無核肝細胞增多，病變程度比模型組輕。有少量炎性細胞浸潤。脂康低劑量組肝細胞脂肪變性較其余組明顯，脂康高劑量組病變程度最輕，可見到正常的肝細胞，有少量炎性細胞浸潤。

2．3 肝臟LDL－R mRNA水平變化 肝臟LDL－RmRNA的陽性表達信號可見細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計算各組的陽性表達率，正常對照組與模型對照組、脂康高劑量組及辛伐他汀對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，模型對照組明顯低于其他各組(P＜0.01)，脂康高劑量組明顯高于其余各組。詳見表1。

3 討 論

本研究利用核酸原位雜交法觀察脂康對高脂血癥兔肝細胞LDL－R基因表達的影響。研究結(jié)果表明，模型對照組高膽固醇兔肝細胞LDL－R mRNA表達水平與正常對照組相比明顯降低，而給高膽固醇兔脂康和相關(guān)藥物后，其肝細胞的LDL－RmRNA表達水平又明顯提高，尤其是脂康高劑量組最為明顯?？梢姡涤酗@著激發(fā)、上調(diào)高血脂兔肝臟細胞LDL－R基因表達的效應(yīng)，提高了LDL－R基因表達強度，這就是脂康從分子水平上調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用的有力證據(jù)。

研究表明，飲食中的膽固醇可以使肝臟LDL－R mRNA水平降低，因此降低了肝臟LDL－R數(shù)量，引起血循環(huán)中LDL的堆積。脂康提高LDL－R基因表達的可能機制是脂康通過理脾，增強了脾的主動運化功能，而脾的正常運化、升清降濁又促進了肝的正常疏泄。動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)主要是肝脾失調(diào)，而痰瘀是其病變之標，因此在治療時以調(diào)脾為主同時注意調(diào)肝、疏肝，從整體上改善了機體代謝環(huán)境，加強了機體代謝機能，顯著降低了血清TC，LDL－C水平。LDL－R基因啟動子5，區(qū)域存在著一個順式作用調(diào)節(jié)元件——膽固醇調(diào)節(jié)單位I(sterol regulatory element I，SRE－I)，SRE－I作為一個條件性增強子，當細胞膽固醇降低時可促進LDL－R基因表達，解除了對LDL－R基因表達的抑制作用，從而為激活肝臟細胞膜LDL－R基因表達創(chuàng)造了條件。從實驗結(jié)果看，治療組肝臟細胞的LDL－R基因表達強度顯著高于正常組，可能是在LDL－R基因表達的抑制解除后，LDL－R的活性大大增強，清除了LDL－C，又不斷促進LDL－R基因表達，加速了脂蛋白的分解。由于LDL－R的這種降解作用，使血中LDL－C更趨減少，從而使脂蛋白的代謝進入了良性循環(huán)。由于基因水平這一調(diào)控機制的存在，使細胞能夠保持膽固醇的精巧平衡。

本方對LDL－R基因表達有顯著的上調(diào)作用，這種作用是否對LDI－R具有翻譯和翻譯后水平的調(diào)節(jié)作用，從而達到調(diào)控血脂水平的目的，還有待進一步研究。

本文編輯 郭懷印