摘要：目的 采用全腦一局灶腦缺血耐受大鼠模型，觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)腦缺血耐受作用的影響。方法 線栓法制備大鼠全腦缺血－局灶腦放血再灌注模型(PC－MCAO)及局灶腦缺血再灌注模型(MCAO)。在不同缺血時(shí)間點(diǎn)觀察通心絡(luò)組、PC－MCAO組及MCAO組大鼠神經(jīng)行為評(píng)分，用免疫組化法檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 神經(jīng)行為評(píng)分在通心絡(luò)組、PC－MCAO組和MCAO組的2h組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，通心絡(luò)24h，3d，5d組均顯著低于對(duì)應(yīng)時(shí)程的PC－MCAO組和MCAO組(P<0.05)；各組缺血半暗帶BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增高，但通心絡(luò)組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)程的PC－MCAO組和MCAO組(P<0.05)。結(jié)論 通心絡(luò)膠囊能提高大鼠局灶腦缺血半暗帶BDNF的表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，誘導(dǎo)腦缺血耐受。

關(guān)鍵詞：通心絡(luò)膠囊；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；缺血預(yù)處理

中圖分類號(hào)：R743.3 R285.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)10－0961－03

有短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)史者腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高，因此，預(yù)防TIA病人腦卒中復(fù)發(fā)十分重要。新近的研究結(jié)果顯示，通心絡(luò)膠囊不僅可以治療急性缺血性腦卒中，也可用于TIA病人的二級(jí)預(yù)防。本研究旨在觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)全腦缺血后再次局灶腦缺血再灌注大鼠的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的影響，探討B(tài)DNF與腦缺血耐受的關(guān)系及通心絡(luò)膠囊的干預(yù)作用，研究通心絡(luò)膠囊在二級(jí)預(yù)防中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 藥物與試劑 通心絡(luò)膠囊，河北以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，主要由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成。兔抗大鼠BDNF單克隆抗體為北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。免疫組化試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。水合氯醛、肝素鈉、4％多聚甲醛均由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床藥理前基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 130只清潔級(jí)健康成年SD雄性大鼠，體重(240～270)g，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前在室溫下(20℃～25℃)保持晝/夜各12 h，環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給普通飼料和自由飲水。隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組(10只)，大腦中動(dòng)脈再灌注(MCAO)組(40只)，全腦缺血(PC－MCAO)組40只，通心絡(luò)組40只，即全腦缺血3 min后給予通心絡(luò)灌胃5d，1g/kg用蒸餾水配至1 mL，每日1次。所有大鼠在全腦缺血后當(dāng)天開始灌胃。MCAO組在再灌注2h，24h，3d，5d后取材，PC－MCAO組及通心絡(luò)膠囊組分別在第2次再灌注2h，24h，3d，5d后取材。假手術(shù)組在實(shí)驗(yàn)開始5d后取材。

1．3 大鼠全腦－局灶缺血模型

1．3．1 全腦缺血模型 采用Simon等制作全腦缺血模型的方法：用10％水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢和頭部固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾。行頸部正中切口，逐層分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min，觀察大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，即產(chǎn)生全腦缺血。術(shù)后提尾無(wú)前肢內(nèi)收屈曲，爬行時(shí)無(wú)追尾，否則應(yīng)剔除。

1．3．2 MCAO模型 采用改良的Zealonga線拴法。單沙尼龍線，直徑0.285mm，加熱將一端烤制光滑呈圓球形，直徑(0.25～0.28)mm，紫外線照射消毒備用。用10％水合氯醛350mg/k8腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢和頭部固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾。行頸部正中切口，逐層分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，避免刺激迷走神經(jīng)。經(jīng)CCA切口插入尼龍線進(jìn)入ICA約(18～20)mm至大腦中動(dòng)脈近端，阻斷大腦中動(dòng)脈血供2h后抽出尼龍線。術(shù)后提尾右前肢內(nèi)收屈曲，爬行時(shí)追尾現(xiàn)象為成功標(biāo)志。術(shù)中用烤燈維持環(huán)境溫度(37.0～37.5)℃。所有大鼠只栓塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈。

1．4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 MCAO后24 h采用Zealonga評(píng)分法。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常者；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者；2分：爬行時(shí)出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈者；3分：行走時(shí)，身體向偏癱側(cè)傾倒者；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者；5分：死亡。評(píng)分為0分和4分以上剔除，隨機(jī)補(bǔ)充保證每組10只。

1．5 腦組織切片制備及BDNF免疫組化染色 各組大鼠在規(guī)定的時(shí)間用10％水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。開胸，經(jīng)左心室灌注37℃的肝素鈉生理鹽水100 mL沖凈血液，再灌注40℃4％多聚甲醛200 mL。開顱取腦，置于4％多聚甲醛中保存(24～48)h。取視交叉前后2 mm的左側(cè)大腦組織，固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm，制成免疫組化片，60℃烤片2 h備用。免疫組化染色采用鏈親和素－生物素－過(guò)氧化物酶法。按試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行染色。BDNF陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈棕色。隨機(jī)選取10×40視野10個(gè)，分別測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。用SPSS10.0版軟件做t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 MCAO后2h，通心絡(luò)組的神經(jīng)功能評(píng)分與PC－MCAO組、MCAO組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。通心絡(luò)組24h，3d，5d的神經(jīng)功能評(píng)分均低于對(duì)應(yīng)時(shí)間的PC-MCAO組和MCAO組(P＜0.05)。通心絡(luò)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分從第5天開始下降。詳見表1。

2．2 BDNF免疫組化染色 全腦－局灶腦缺血再灌注2h，24h，3d，5d后各組均可見BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，通心絡(luò)組再灌注2h，24h，3d，5d BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，PC－MCAO再灌注組2h，24h，3d BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增高，5d時(shí)開始下降，MCAO組2h，24h組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增高，但從3d時(shí)就開始下降。通心絡(luò)組2h，24h，3d，5d BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別高于PC-MCAO組和MCAO組的對(duì)應(yīng)時(shí)程組(P＜0.05)。詳見表2。

3 討 論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族是一組由神經(jīng)元支配的靶細(xì)胞分泌的小分子多肽，它們與神經(jīng)元的存活和神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)密切相關(guān)，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)具有支持和促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)缺血后立即側(cè)腦室灌注BDNF，腦梗死總體積可以減小33％，皮層梗死體積減小37％。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在腦缺血時(shí)BDNF的表達(dá)上調(diào)，在腦缺血中具有保護(hù)半影區(qū)神經(jīng)元、抵抗損傷、促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù)、抑制遲發(fā)性神經(jīng)元壞死、減小梗死體積的作用。主要是通過(guò)下面的機(jī)制：①抑制凋亡，腦缺血急性期細(xì)胞凋亡主要位于缺血半暗帶，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡主要也是細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF是調(diào)節(jié)Bel－2相關(guān)基因表達(dá)的上游信號(hào)，通過(guò)增加Bcl－2表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)和體外均有神經(jīng)保護(hù)作用；BDNF還能通過(guò)阻止Caspase－3的活性而抑制細(xì)胞凋亡。②影響神經(jīng)細(xì)胞的分化和生存，維持神經(jīng)元的存活，修復(fù)受損神經(jīng)元。③拮抗興奮性氨基酸，減輕毒性損傷。急性腦缺血時(shí)，谷氨酸濃度增高使大量Ca²⁺進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，破壞細(xì)胞內(nèi)外的離子平穩(wěn)，導(dǎo)致缺血中心壞死和半暗帶神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。BDNF能夠誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)，抑制Ca²⁺內(nèi)流，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度。④BDNF增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化酶等的含量，抑制腦缺血后一氧化氮合酶的表達(dá)、膠質(zhì)細(xì)胞的活性和吞噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少自由基的生成，減輕自由基損傷。腦缺血后蛋白激酶C(PKC)快速失活，BDNF增強(qiáng)PKC的活性而實(shí)現(xiàn)腦缺血神經(jīng)保護(hù)。BDNF還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與分化，刺激神經(jīng)血管的生成，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。通過(guò)以上機(jī)制BDNF減輕腦缺血時(shí)半暗帶神經(jīng)元損傷，誘導(dǎo)腦缺血時(shí)產(chǎn)生缺血耐受性。

研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后產(chǎn)生的痰瘀熱毒害絡(luò)損髓是抑制神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖分化的關(guān)鍵性病理因素，而解毒通絡(luò)是治療的重要方法。通心絡(luò)膠囊能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞；降低膽固醇和低密度脂蛋白水平；抑制血小板聚集和釋放；抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖；降低血液黏度和纖維蛋白濃度；增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO含量；降低血漿內(nèi)皮素水平；具有益氣化瘀、解毒通絡(luò)、搜風(fēng)解痙之功效，從而祛除了抑制神經(jīng)，細(xì)胞增殖分化的病理因素，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化。本研究采用全腦－局灶腦缺血模型，模擬臨床中丁IA病人再發(fā)腦梗死的腦部病變。結(jié)果顯示，BDNF在腦缺血半暗區(qū)的皮質(zhì)和皮層下的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，通心絡(luò)組第2次再灌注后BDNF的表達(dá)隨時(shí)間逐漸增高，說(shuō)明通心絡(luò)能夠誘導(dǎo)BDNF，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。Kitagawa等發(fā)現(xiàn)了腦缺血耐受現(xiàn)象，指出腦缺血耐受是由于缺血預(yù)處理增加神經(jīng)元對(duì)致死性腦缺血的耐受并減輕致死性腦缺血所造成的損傷。在本研究中PC－MCAD組第2次再灌注后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于MCAO組，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于MCAO組，說(shuō)明缺血預(yù)處理能夠減輕再次腦缺血的損傷，具有腦保護(hù)作用，與Kitagawa的研究相一致。通心絡(luò)組在各時(shí)程的BDNF表達(dá)均高于對(duì)應(yīng)的PC－MCAO組，通心絡(luò)組第2次再灌注后BDNF的表達(dá)增高在第5天仍處于較高水平，而PC－MCAO組BDNF的表達(dá)在第3天達(dá)高峰之后降低，提示通心絡(luò)進(jìn)一步使BDNF的表達(dá)增加，并能使BDNF的表達(dá)在較長(zhǎng)時(shí)間維持于較高的水平。通心絡(luò)組第2次再灌注后24h，3d，5d的神經(jīng)行為評(píng)分則低于對(duì)應(yīng)的PC－MCAO組，顯示通心絡(luò)各組神經(jīng)功能缺損較PC－MCAO各組減輕，與BDNF表達(dá)水平的變化具有一致性。在短暫腦缺血后給予通心絡(luò)治療能夠進(jìn)一步增加BDNF的表達(dá)，增強(qiáng)腦的缺血耐受，更加減輕再次腦卒中所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

BDNF是一種多效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)腦的缺血性損傷具有抵抗作用，可誘導(dǎo)腦的缺血耐受，促進(jìn)神經(jīng)元功能的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，由于外源性BDNF難以通過(guò)血腦屏障，無(wú)論通過(guò)側(cè)腦室或靜脈給藥都不能很好發(fā)揮其保護(hù)作用，因此給予外源性通心絡(luò)增加內(nèi)源性BDNF在缺血性損傷腦組織中的表達(dá)，是增進(jìn)由缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦的缺血耐受效應(yīng)的重要途徑。

本文編輯 郭懷印