【摘要】 目的 擴(kuò)增人幽門螺桿菌（Hp）熱休克蛋白A(HspA)編碼基因并構(gòu)建其重組表達(dá)載體，進(jìn)行核苷酸序列分析，并在E.coli BL21中表達(dá)，為疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

方法 利用PCR技術(shù)從Hp基因組DNA中擴(kuò)增熱休克蛋白A（HspA）基因片段，目的基因經(jīng)SacⅠ和XhoⅠ雙酶切、純化后，插入pET32a(+)載體。以含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)PCR、酶切、測序分析表明，插入的基因片段為Hp HspA編碼基因，與GenBank報道的相比較，核酸同源性達(dá)98%。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)的融合蛋白分子量約為33 KD，其中目的蛋白的分子量約為13 KD。結(jié)論 成功地克隆并表達(dá)了Hp HspA編碼基因，為HspA蛋白質(zhì)疫苗的研制和快速診斷試劑盒的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 幽門螺桿菌；熱休克蛋白A；重組載體；基因表達(dá)

文章編號：1003-1383(2007)06-0666-03中圖分類號：R 392-33文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，在人群中的感染率極高，我國普通人群的感染率為50%～80%，每年新增感染人數(shù)近千萬［1］。Hp不僅是導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織(MALT)淋巴瘤等胃部疾病的主要致病細(xì)菌，而且與腸道外疾病的發(fā)生也有顯著的作用，故已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入第一類致癌原［2~4］。根據(jù)Hp的感染，臨床上多采用復(fù)合抗生素療法，雖然可以達(dá)到一定的效果，但卻存在再次感染、誘導(dǎo)耐藥菌株流行、藥物副作用和費(fèi)用較高等問題，且不能達(dá)到預(yù)防Hp感染的目的。因此，發(fā)展Hp疫苗是預(yù)防Hp感染最有效、最有前景的方法。Hp的致病性包括它的動力、黏附力、尿素酶、磷脂酶A、熱休克蛋白和毒素等，其中HspA為所有的Hp共同的抗原成分，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究采用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建了含HspA基因的重組質(zhì)粒，并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，為Hp疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料 ①菌株和質(zhì)粒：標(biāo)準(zhǔn)Hp菌株11637由本校微生物學(xué)教研室提供；DH5α、BL21菌株和pET32a(+)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。②主要試劑：PrimeSTAR聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（SacⅠ和XhoⅠ）、DNA Marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品。③引物設(shè)計：通過GenBank查詢，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計 Hp HspA編碼基因的引物P1和P2，P1的序列為5’GCCGAGCTC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG3’，P2的序列為: 5’CCGCTCGAGGTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’。P1引物中引入了SacⅠ酶切位點(diǎn)，P2引物中引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

2.方法

(1)Hp染色體DNA的提取 將Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)布氏肉湯培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)增菌后，取增菌后的菌液按照DNA提取試劑盒說明進(jìn)行染色體DNA的提取。

(2)HspA基因的擴(kuò)增 在50 μl反應(yīng)體系中，分別加入dNTP 4 μl，基因組DNA（作為模板）3 μl及濃度各為20μmol/L的P1和P2引物各0.5μl，以及PrimeSTAR聚合酶0.5 μl，按照下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即98℃變性2 min，然后98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸2 min。所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠回收。

(3)重組載體的構(gòu)建 將純化的PCR產(chǎn)物和載體pET32a(+)，分別以SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，并用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。將酶切純化的目的基因和pET32a(+)按5∶1（摩爾數(shù)）比例，在16℃條件下連接過夜。將10 μl連接產(chǎn)物加入一支感受態(tài)細(xì)胞中混懸，依次冰浴30 min、42℃水浴90 s、冰浴5 min。最后再在連接產(chǎn)物內(nèi)加入900 μl LB培養(yǎng)液，于37℃復(fù)蘇1 h后離心，棄去上清，余少許培養(yǎng)液與沉淀混勻后接種于LB+氨芐青霉素100 mg/L的平皿上，放37℃孵箱過夜。

(4)重組載體的鑒定 ①PCR鑒定：于次日在平皿上分別挑取單個菌落，以細(xì)菌本身為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94℃變性10 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)，最后再72℃延伸2 min。所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

②雙酶切鑒定基因測序分析：將經(jīng)菌落PCR初篩為陽性的重組菌接種于5 ml LB+氨芐青霉素100 mg/L培養(yǎng)液中，于37℃以250 r/min培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒進(jìn)行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，同時將含陽性重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司對插入片段進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與預(yù)期一致的重組質(zhì)粒命名為pET32a(+)/HspA。

(5)重組載體pET32a(+)/HspA在E.coli中的表達(dá) 分別將重組載體及載體pET32a(+)轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，隨后挑選含重組載體的單個菌落接種于LB+氨芐青霉素100 mg/L中，于37℃培養(yǎng)A600=0.4～0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)3 h，以10 000 r/min離心2 min。收集菌體，加入等體積蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行SDSPAGE。

結(jié)果

1.熱休克蛋白A（HspA）編碼基因的擴(kuò)增 以Hp基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與實(shí)際HspA編碼基因大小相符。

2.重組載體的鑒定 以含重組載體的DH5α菌為模板，按照上述PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1）。結(jié)果顯示：以含重組載體的DH5α菌為模板均能擴(kuò)增出1條約為357 bp的條帶，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計相一致。

3.HspA基因片段的序列分析 將重組載體以T7為引物進(jìn)行序列分析（上海英駿生物技術(shù)有限公司），并采用電腦DNA分析輔助軟件，對所測定的DNA序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入的目的片段為HspA基因，與GenBank 上公布的HspA核酸序列相比同源性為98%左右。

4.表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含重組載體的菌體蛋白可見Mr為33 KD的融合蛋白，含pET32a(+)的菌體蛋白可見Mr約為20 KD的蛋白（圖2）。

3. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后含pET32a(+)載體的菌體蛋白；

4. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)含pET32a(+)載體的菌體蛋白；5. 陰性對照 

討論

熱休克蛋白(heat shock protein， Hsp)又稱應(yīng)激蛋白（stress protein， SP），是生物細(xì)胞在某些環(huán)境因素或多種應(yīng)激條件下，誘導(dǎo)合成或合成增加的一類進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白質(zhì)［5］。Hp的HspA是Hp共有的抗原成分，在Hp的致病機(jī)制中起著重要的角色，它可介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，觸發(fā)胃上皮細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)，在胃黏膜慢性病變的發(fā)展和持續(xù)中充當(dāng)啟動因子，介導(dǎo)病原與宿主的識別與粘附。另外，由于HspA蛋白序列在不同Hp菌株間高度保守，因此將其單獨(dú)使用或與其他抗原聯(lián)用，均可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)免疫，是Hp疫苗的理想組分。所以認(rèn)為，以熱休克蛋白為基礎(chǔ)的（核酸DNA，或蛋白質(zhì)）疫苗不失為一種有效的Hp疫苗。

我們成功地將Hp HspA編碼基因進(jìn)行了克隆，對所構(gòu)建的重組載體利用重組菌作為模板進(jìn)行PCR來鑒定，對于PCR陽性的重組菌再進(jìn)行質(zhì)粒提取的酶切鑒定和序列分析，提高了重組結(jié)果鑒定的效率及準(zhǔn)確性。最終經(jīng)序列分析結(jié)果顯示HspA基因全長為357 bp，與GenBank 上公布的hspA核酸序列相比同源性為98%左右。

Hp HspA編碼基因編碼118個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為13 KD，由于分子量較小，故我們采用原核表達(dá)載體pET32a(+)，其主要特點(diǎn)是，除能夠編碼6個組氨酸殘基外，還帶有可編碼硫氧還蛋白的TrxA基因。外源基因經(jīng)多克隆位點(diǎn)插入后，可與TrxA基因一起融合表達(dá)。融合表達(dá)不僅提高了表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而且由于相對分子質(zhì)量增大，SDSPAGE更容易分析鑒定。從SDSPAGE的結(jié)果表明，含重組載體的菌體蛋白可見Mr為33 KD的融合蛋白，即硫氧還蛋白HspA的分子量約為33 KD，而含pET32a(+)的菌體蛋白可見Mr約為20 KD的蛋白，與硫氧還蛋白的分子量相符。另外，由于原核表達(dá)載體pET32a(+)的6個組氨酸殘基可與Ni+NTA瓊脂糖樹脂中Ni2+結(jié)合，從而利于對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。而外源蛋白與硫氧還蛋白之間具有腸激酶和凝血酶識別位點(diǎn)，從而也方便了外源蛋白與硫氧還蛋白的分離。

在本研究中，我們成功地克隆了Hp HspA編碼基因，構(gòu)建了重組載體并進(jìn)行了表達(dá)，為今后制備安全、高效的疫苗，以及制備ELISA等快速診斷試劑盒提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］Pounder RE， Ng D. The prevalence of Helicobacter phlori infection in different countrie［J］. Aliment Pharmacol Ther， 1995， 9(Suppl.2):33-39.

［2］Suganuma M， Kurusu M， Okabe S， et al. Helicpbacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori［J］. Cancer Res， 2001， 61:6356.

［3］Loughlin MF. Novel therapeutic targets in Helicobacter pylori［J］. Expert Opin Ther Targets 2003，7:725-735.

［4］Lamarque D， M Peek R Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Helicobacter 2003，8(Suppl 1):21-30.

［5］Ning XX， Wu KC， Shi YQ， et al. Construction and expression of gastric cancer MG7 mimic epitopic fused to heat shock protein 70［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001，9:892-896.

(收稿日期：2007-08-08 修回日期：2007-10-17）

(編輯：梁明佩)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。