摘要：目的在氯化鋰一匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中觀察c-fos蛋白表達(dá)的時(shí)程變化。方法采用氯化鋰一匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型，觀察大鼠的行為改變，并用免疫組化方法觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)c—fos蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h，1d時(shí)腦內(nèi)c—fos蛋白表達(dá)最高，3d時(shí)表達(dá)次之，7d時(shí)極少數(shù)表達(dá)并接近對(duì)照組表達(dá)水平。結(jié)論癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦內(nèi)c—fos蛋白表達(dá)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間；在此時(shí)期應(yīng)給予干預(yù)措施，以減低腦內(nèi)神經(jīng)元損傷可能。

關(guān)鍵詞：氯化鋰一匹羅卡品；癲癇持續(xù)狀態(tài)；c—fos蛋白

中圖分類號(hào)：R749.1 R255.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672—1349(2007)05—0419—02

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)是指一次癲癇發(fā)作持續(xù)30rain以上或連續(xù)發(fā)作多次，發(fā)作間歇期意識(shí)不恢復(fù)者。癲癇持續(xù)狀態(tài)是神經(jīng)科危急重癥之一，癲癇持續(xù)狀態(tài)中腦損害明顯的癲癇約占61％～88％，必須從速制止發(fā)作，否則危及生命。目前，作為神經(jīng)元活動(dòng)的標(biāo)記物fos蛋白已經(jīng)廣泛用于研究動(dòng)物神經(jīng)元對(duì)癲癇發(fā)作的反應(yīng)。不同的癲癇模型均可以誘發(fā)fos蛋白在大腦神經(jīng)元中表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)選用氯化鋰一匹羅卡品誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)，觀察fos蛋白在腦內(nèi)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性Wistar大鼠32只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重200g～250g。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組26只和對(duì)照組6只，飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。

1．2氯化鋰－匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型制作 大鼠腹腔注射氯化鋰3mEq／kg(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司)，18h后再腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30mg／kg(Sigma公司)。對(duì)照組大鼠給予生理鹽水腹腔注射。給藥大鼠在15min～45min出現(xiàn)反復(fù)強(qiáng)直一陣攣發(fā)作，形成癲癇持續(xù)狀態(tài)。按照經(jīng)典的Racine癲癇發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癲癇的行為觀察記錄。0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)，正常行為狀態(tài)；I級(jí)：面部陣攣，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼等；Ⅱ級(jí)：I級(jí)加節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：Ⅱ級(jí)加前肢痙攣；Ⅳ級(jí)：Ⅲ級(jí)加后肢站立；V級(jí)：Ⅳ級(jí)加摔倒。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物發(fā)作級(jí)別均達(dá)到Ⅳ級(jí)以上。于癲癇持續(xù)狀態(tài)后60 min腹腔注射地西泮(安定，4 mg/kg)以終止癲癇持續(xù)狀態(tài)，降低病死率。實(shí)驗(yàn)組按照發(fā)作后6h，1d，3d，7d再分為實(shí)驗(yàn)1組、2組、3組、4組。

1．3標(biāo)本采集與處理實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后6 h，1d，3d，7d及對(duì)照組大鼠，用5％水合氯醛按5mL／kg腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。鼠腦組織在4％的多聚甲醛中固定24h，經(jīng)石蠟包埋后，在海馬部位做矢狀位切片，片厚約10μm。

1．4 c—fos免疫組化染色常規(guī)間接漂染法進(jìn)行免疫組化染色(試劑選用北京中山生物技術(shù)有限公司)。一抗為兔抗c—fos蛋白多克隆抗體，二抗為抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶。

1．5圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Mias(2000型)圖像分析系統(tǒng)對(duì)海馬及海馬皮層clos蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢測(cè)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多樣本均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2 1行為學(xué)觀察對(duì)照組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。模型組大鼠在給予匹羅卡品后15min～30nln均出現(xiàn)洗臉樣動(dòng)作、節(jié)律性咀嚼、點(diǎn)頭等面部痙攣樣動(dòng)作；隨后出現(xiàn)前肢陣攣，之后很快表現(xiàn)為前肢陣攣伴站立，進(jìn)一步發(fā)展到全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴站立、摔倒，反復(fù)發(fā)作，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)。模型組大鼠成功24只，成功率92.31％，死亡2只，死亡率7.69％。

2．2 c-fos免疫組化染色結(jié)果 c-fos陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色，圓形或橢圓形，胞核著色最深?對(duì)照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)及皮層有極少數(shù)c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。模型組大鼠癲癇持續(xù)狀念后6h，1d海馬結(jié)構(gòu)及顳葉皮層c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞顯著表達(dá)；大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后3d，海馬結(jié)構(gòu)及皮層c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞明顯表達(dá)；大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后第7天，海馬結(jié)構(gòu)及皮層c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞極少數(shù)表達(dá)，接近對(duì)照組。詳見(jiàn)表1。

3 討論

氯化鋰－匹羅卡品致癇大鼠模型是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外麻用較多的一種公認(rèn)的邊緣系統(tǒng)癲癇模型，是Honchar等于1983年首次報(bào)道的，該模型使匹羅卡品的用量減少，降低了因匹羅卡品毒副反應(yīng)所導(dǎo)致的動(dòng)物死亡率，是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)和復(fù)雜部分性發(fā)作對(duì)腦部影響最常用的動(dòng)物模型之一。故本實(shí)驗(yàn)選用氯化鋰－匹羅卡品誘發(fā)頌癇持續(xù)狀態(tài)模型，成功率較高為92.31％，死亡率為7.69％，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型是研究撕癇持續(xù)狀態(tài)的理想模型而且，氯化鋰和匹羅卡品腹腔注射間隔18h～20h，是誘發(fā)癲癇的最佳時(shí)間，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

c-fos基因作為神經(jīng)功能活動(dòng)的代謝性標(biāo)志物，在癲癇研究中被大量應(yīng)用。它屬于即早基因(inmlediate early genes，lEG)，為細(xì)胞受刺激后表達(dá)的基因，包括c-fos，c-jun，jun－b，jun—d等。c-fos基因編碼的c-fos蛋白是一種核蛋白，c-fos蛋白與Jun家族蛋自形成一個(gè)二聚體AP－1(active protein－1，AP-1)，AP-1復(fù)合物與細(xì)胞基因中的AP-1序列結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)c-fosmRNA和fos蛋白水平均很低，而在各種化學(xué)和電刺激所造成的癲癇活動(dòng)中，其表達(dá)很顯著。c-fos和fos的大量表達(dá)將干細(xì)胞核的修復(fù)功能而使細(xì)胞走向凋亡。1987年Dragunow和Robertson在研究過(guò)程中首次發(fā)現(xiàn)，電刺激誘導(dǎo)的癲癇活動(dòng)能夠快速而短哲的使大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞核內(nèi)的c-fos蛋白免疫反應(yīng)活性增強(qiáng)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，c-fos蛋白的表達(dá)程度與癲癇所致的神經(jīng)元活動(dòng)程度有關(guān)。而且c-fos蛋白的表達(dá)情況也隨著發(fā)作后時(shí)間間隔的變化而變化，Wagner等報(bào)道，c-fos在大鼠缺血缺氧96 h可以高表達(dá)并且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，推斷其原因可能為缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元遲發(fā)性壞死所致

本實(shí)驗(yàn)成功誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，并對(duì)c-fos蛋白表達(dá)時(shí)程作初步研究。結(jié)果顯示在1h的癲癇持續(xù)狀態(tài)結(jié)束后6 h及1d，在大鼠海馬及顳葉皮層c-fos蛋白表達(dá)顯著；大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后3d，海馬結(jié)構(gòu)及皮層c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞明顯表達(dá)；大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d，海馬結(jié)構(gòu)及皮層c-fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞極少數(shù)表達(dá)，接近對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后如小采取干預(yù)措施，腦內(nèi)神經(jīng)元損傷將持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究比較，c-fos蛋白表達(dá)顯著和表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，可能與以下因素有關(guān)：①所選擇的模型不同，以往研究選用的是杏仁核電刺激誘發(fā)癲癇；②癲癇持續(xù)狀態(tài)的時(shí)間和強(qiáng)度不同，本實(shí)驗(yàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠發(fā)作均達(dá)到Racine 4、5縱發(fā)作，持續(xù)時(shí)間達(dá)1h，Kondralyev等研究證實(shí)癲癇持續(xù)狀態(tài)超過(guò)30min，神經(jīng)元就會(huì)壞化。本實(shí)驗(yàn)中c-fos蛋白表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)可能與神經(jīng)元壞死有關(guān)；③所選擇的動(dòng)物不同，本實(shí)驗(yàn)選擇的大鼠為2月齡雄性大鼠，體重200g～250g，較易誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)

fos蛋白或c-fos mRNA的表達(dá)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)的代謝性標(biāo)志物，對(duì)于研究癲癇持續(xù)狀態(tài)神經(jīng)元的損傷機(jī)制損傷持續(xù)時(shí)間有重要的意義，可為進(jìn)行干預(yù)措施提供依據(jù)。目前，fos蛋白或c-fosmRNA已廣泛應(yīng)用于對(duì)癲癇的定位研究，探討癲癇發(fā)生的機(jī)制，抗癲藥物的篩選和評(píng)價(jià)，隨著分子生物學(xué)和免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，c-fos/fos的表達(dá)定量會(huì)更加精確，無(wú)論單獨(dú)應(yīng)用還是與其他方法合用，都有重要的參號(hào)價(jià)值，將會(huì)在癲癇的研究中發(fā)揮更大的作用。

作者簡(jiǎn)介：薛國(guó)芳(1976—)，女，在讀碩士，現(xiàn)工作于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(郵編：030001)；鄭輯英、李光來(lái)、王荔，工作于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；劉勇，現(xiàn)為日本國(guó)立弘前大學(xué)醫(yī)學(xué)部在讀博士

(本文編輯 王雅潔)