關鍵詞貝萊斯芽孢桿菌20-10;正交試驗；響應面試驗；高密度液體發(fā)酵；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號S-3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2025）14-0009-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.14.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

dy on High Density Liquid Fermentation Technology of a Rice Growth Promoting Bacillus velezensis 20. YANG Hua，HU Zhan，WU Shan-dong et al（Hunan Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009）

AbstractThesinglefactorandorthgonalexperimentswereusedtooptiizethecompostionandcontentofliqudculturemedforBacil lus velezensis 2O-1O，the optimal culture medium components were maltose 20.0g/L ，starch 10.0g/L ，yeast paste 12.5g/L ，NaCl 1.0g/L （2 （NH₄）₂SO₄3.0g/L . In this culture medium，the bacteria concentration was 45.5×10⁸ CFU/mL，which increased by 106.82% compared to thebasicculturemdiufeeingcluredinstrain2O-10shakeflasksfor7hourseotialfermentationparametersobdbtimizing the fermentation conditions of 20-1Othrough single factor and response surface experiments were inoculation amount 2.0% ， temperature 30% ，and pH7.0 .Undertheseoptimized conditions，thebacterial concentrations obtained by expandingthe cultivation of the strains in 20L and 500L fermenters for 64 hours were 52.0×10⁸ and 160.5×10⁸ CFU/mL，respectively，which were 1.36 and 6.30 times higher than the basic culture medium.

KeywordscileesisOgalexpt;spseeepent;Hghsitydatio timization

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）是一種革蘭氏陽性好氧的產(chǎn)芽孢桿菌，廣泛分布在土壤、植物表面和根際[，因其在生長與繁殖過程中能夠產(chǎn)生種類豐富的次級代謝產(chǎn)物，并且具有優(yōu)秀的促植物生長和廣譜而有效的抑菌特性被關注[2]。貝萊斯芽孢桿菌促生作用機制包括分泌多種促生因子，直接促進植物生長[3；定殖于植物根際或組織內，誘導提高植物抗病力和生長抗逆性，通過與植物互作間接促進植物生長[4]；招募有益微生物定殖于植物根際，改善土壤微生態(tài)結構，從而促進植物生長[5]。因此，貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域具有廣闊的應用前景，已有多種貝萊斯芽孢桿菌被用作微生物菌肥或微生物菌劑的生產(chǎn)菌株[6-7]，在農(nóng)業(yè)綠色高效生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用

隨著貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域中的應用越來越廣，其發(fā)酵工藝和工業(yè)化生產(chǎn)也成為研究熱點之一。實現(xiàn)菌株高密度和高產(chǎn)率培養(yǎng)是近幾年發(fā)酵工業(yè)的目標和方向之一。目前，已有較多關于貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵的研究報道，如劉芳等[8]研究表明，適宜貝萊斯芽孢桿菌CY30發(fā)酵的培養(yǎng)基為甘薯粉 37.35g/L 、酵母膏 15.29g/L ，優(yōu)化后培養(yǎng)基的芽孢產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了 53% 。方翔等研究表明，貝萊斯芽孢桿菌XP-27的最佳培養(yǎng)基配方為牛肉膏1.00% 、淀粉 1.50% 、 K₂HPO₄ （20 0.05% 、 MgSO₄?7H₂O 0.10%，優(yōu)化后的菌株發(fā)酵液對桑椹菌核病病原菌核盤菌的抑菌效果比優(yōu)化前提高了 78.18% 。雖然不同的貝萊斯芽孢桿菌在理化性質上對碳氮源和營養(yǎng)因子的利用特性一致，但它們在基因、轉錄和代謝水平上依然存在較大的個體差異，這導致不同的貝萊斯芽孢桿菌對相同營養(yǎng)因子的利用水平也存在差異。因而不同的貝萊斯即使使用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵水平也存在差異[10]。針對具有應用前景的優(yōu)異貝萊斯芽孢桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，對其實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品研制及其推廣應用均具有重要的現(xiàn)實意義。

貝萊斯芽孢桿菌20-10是一株來自水稻根際土壤的微生物。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較高的解鉀水平，同時可高效合成并分泌IAA和鐵載體，能顯著提高水稻種子萌發(fā)率并促進幼苗生長[]，因而具有較大的應用和開發(fā)潛力。但將該菌廣泛投入生產(chǎn)并在環(huán)境中達到足夠的數(shù)量級，還需要進一步提高該菌的發(fā)酵水平。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對微生物數(shù)量有很大影響[12]，為實現(xiàn)該菌株的高密度發(fā)酵，促進其轉化應用，該研究采用單因子預篩選、正交試驗和響應面的方法，以發(fā)酵液 和有效活菌數(shù)為指標，對菌株20-10的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和比例進行篩選和優(yōu)化，摸索菌株20-10高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方和最適發(fā)酵條件，并進行了搖瓶試驗驗證以及 20L 發(fā)酵罐小試和 500L 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，以期為該菌株規(guī)模化生產(chǎn)和實際應用提供理論依據(jù)和技術支撐。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試菌株。試驗所用菌株貝萊斯芽孢桿菌20-10，從遼寧阜新的水稻根際土壤中篩選獲得，并在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCCNO：M20221980。

1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基[13]、NB 培養(yǎng)基[14]、GYM發(fā)酵培養(yǎng)基[15] MY 發(fā)酵培養(yǎng)基[6]、GS培養(yǎng)基[17]按文獻方法配制好后，均于 115‰ 高溫高壓滅菌 30min 。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種活化及種子液制備。將貝萊斯芽孢桿菌20-10在LB固體平板上劃線， 30^cC 培養(yǎng)1～2d，挑取單個菌落于裝有 10mL LB液體培養(yǎng)基的 250mL 錐形瓶中，于 30% 、180r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 8h 作為種子液備用。

1.2.2基礎培養(yǎng)基的篩選。配制GYM、MY、GS和NB4種液體培養(yǎng)基，調節(jié) ΔpH 至7.0～7.2，以 50mL 的裝液量分裝至500mL 錐形瓶中，按 2% 的體積比將菌株種子液接種至以上4種不同的培養(yǎng)液中， 30°C，180r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72h 每隔 24h 測量發(fā)酵液在 600nm 處的吸光度，同時采用平皿菌落計數(shù)法[18]測定發(fā)酵液中菌株的有效活菌數(shù)。試驗重復3次，根據(jù)3次試驗結果平均值繪制菌株生長曲線。

將培養(yǎng) ^72h 的發(fā)酵液轉移至 50mL 離心管， 4°C 、 10000r/min 離心 10min ，去上清后，將離心管放置于 60^°C 烘 箱烘干至恒重，稱量并計算發(fā)酵液中細胞干重。

以發(fā)酵液不同時間段的 、有效活菌數(shù)和 ^72h 培養(yǎng)后細胞十重作為考察指標，評價不同培養(yǎng)基中菌株20-10的生長情況，確定最優(yōu)基礎培養(yǎng)基。

1.2.3正交試驗優(yōu)化基礎培養(yǎng)基。采用微孔培養(yǎng)板結合正交試驗對篩選出來的基礎培養(yǎng)基MY培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽濃度進行優(yōu)化。對MY培養(yǎng)基中的麥芽糖（A）、淀粉（B）酵母膏（C）氯化鈉（D）和硫酸銨（E）5種成分進行了4個水平的正交試驗設計（表1），并根據(jù)設計結果配制不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基。由于碳酸鈣為不溶性顆粒，在微孔培養(yǎng)板中不易控制添加量，因此未將其列入正交試驗的因子篩選系列。正交試驗在96孔微孔板中進行，每孔加人 1mL 根據(jù)正交試驗設計的不同配比的發(fā)酵培養(yǎng)基，按 2% 接種量加入貝萊斯芽孢桿菌20-10的種子液，加蓋置于微孔板恒溫振蕩器中 30°，800r/min 培養(yǎng) 3d 每隔 ^4h 在酶標儀上測定培養(yǎng)液在 600nm 處的吸光度。同一微孔板每種配方培養(yǎng)基進行3個重復，且重復2個同樣配制的微孔板。采用Excel根據(jù)平行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計平均值和標準差，并繪制菌株生長曲線。1.2.4搖瓶培養(yǎng)確定優(yōu)化培養(yǎng)基配比。以有效活菌數(shù)為指標，用搖瓶試驗驗證優(yōu)化后的培養(yǎng)基配比。

1.2.5響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件。

1.2.5.1單因素試驗。在優(yōu)化后的MY培養(yǎng)基的基礎上，分別考察不同接種量 （1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%） 、不同裝液量 （20%，30%，40%，50%，60%） 、不同轉速（170、180、190、200和 |210r/min ）、不同初始 pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0） 和不同溫度 （24，26，28，30，32，9C 條件下發(fā)酵 ^72h 貝萊斯芽孢桿菌20-10的有效活菌數(shù)。

1.2.5.2響應面試驗。根據(jù)單因素試驗結果，將 pH（a） 、接種量（b）、溫度 （c） 設為試驗自變量，將有效活菌數(shù)（Y）作為模型響應值，采用DesignExpert13.0軟件的Box-Behnken設計3因素3水平的響應面試驗，各因素水平如表2所示。

1.2.6 20L 發(fā)酵罐小試及 500L 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)。 20L 發(fā)酵罐裝液量 10L ，配制優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié) pH7.0 ，121^°C 滅菌 30min ，將貝萊斯芽孢桿菌20-10種子液以200mL 的接種量接入含有 10L 發(fā)酵培養(yǎng)基的 20L 發(fā)酵罐中，在 30% 、表層通氣量 88mL/min 攪拌速度 180r/min 條件下進行培養(yǎng)。每 24h 取樣，計算發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)。

500L 發(fā)酵罐裝液量 250L ，接人 500mL 種子液，發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同上。每 24h 取樣，計算發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用WPS Office 2020、Design Expert13.0對試驗數(shù)據(jù)進行記錄、整理、分析和制圖，采用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行相關的統(tǒng)計分析，利用最小顯著差異法（Leastsignificantdifference，LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對菌株20-10的影響采用GYM、MY、GS、NB4種基本培養(yǎng)基培養(yǎng)貝萊斯芽孢桿菌20-10，分別在24、^48，72h 對發(fā)酵液 OD_600nm 、有效活菌數(shù)和生物量進行檢測，結果如圖1和圖2所示。從圖1可以看出，在4種不同基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵 24h 發(fā)酵液的 各不相同，其中，以MY發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基時， ΔOD_600nm 最大，為15.07，顯著高于其他培養(yǎng)基;發(fā)酵48h 時，MY 發(fā)酵培養(yǎng)基的OD600mm仍然高于其他培養(yǎng)基，為21.76；發(fā)酵 ^72h 時，GYM、MY、GS、NB 培養(yǎng)基的 分別為18.99、27.88、1.97、7.69，其中，MY發(fā)酵培養(yǎng)基 最大。

同時，對發(fā)酵 ^72h 發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)和細胞干重進行統(tǒng)計，結果如圖2所示。從圖2可以看出，貝萊斯芽孢桿菌20-10在MY培養(yǎng)基中的有效活菌數(shù)最高，達到了 14.0× 10⁸CFU/mL ，遠高于其他3種培養(yǎng)基（GYM、GS和NB）發(fā)酵^72h 的有效活菌數(shù)（ 9.2×10⁸?1.9×10⁸ 和 6.5×10⁸CFU/mL ）。細胞干重的統(tǒng)計結果也顯示，菌株20-10在MY培養(yǎng)基培養(yǎng)72h ，細胞干重最重，為 6.73g/L ，遠高于GYM、GS和NB培養(yǎng)基中獲得的細胞干重（2.65、0.24和 0.10g/L ）°

結合菌株發(fā)酵液的 0D_600nm 、有效活菌數(shù)和干重的結果，可以確定菌株20-10在MY培養(yǎng)基中具有最快的生長速度、最高的有效活菌數(shù)和細胞干重，因此選擇MY培養(yǎng)基作為菌株20-10的基礎培養(yǎng)基，在后續(xù)試驗中進行優(yōu)化研究。

2.2正交試驗在篩選獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，對MY發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分進行5因素4水平正交試驗設計（表1），確定各成分最佳配比。

根據(jù)正交試驗設計，每隔 ^4h 測定發(fā)酵液 OD_600nm ，并繪制菌株生長曲線（圖3）。從圖3可以看出，不同試驗組之間菌體生長情況不同，部分組間差異顯著。由于細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)液體積小，轉速快，初期培養(yǎng)液中營養(yǎng)和溶氧充足，菌株很快進入對數(shù)期生長，并在 24～28h 進入穩(wěn)定期，此時，菌體0D_600nm 最大，隨后因培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分的消耗和大量細胞間的競爭等群體效應開始逐步進入衰亡期。

因為各組合培養(yǎng) 28h基本都處于穩(wěn)定期，菌體OD.00mm最大，因此選擇 28h 的菌體 進行統(tǒng)計分析，結果如表3所示。通過極差分析，培養(yǎng)基組分對貝萊斯芽孢桿菌20-10生長速度影響從大到小依次為C（酵母膏） gt;B （淀粉） gt;A （麥芽糖） gt; E（硫酸銨） gt;D （氯化鈉）。根據(jù)對正交試驗結果的統(tǒng)計分析，理論上影響菌株生長速度的最優(yōu)組合為A₃B₂C₄D₂E₂ L

此外，從16個試驗組合28h發(fā)酵液的平均菌體OD600m結果可得出，試驗7組合（ A₂B₃C₄D₁E₂ ）在 28h 時 最大，達到1.305，其次為試驗8組合（ （A₂B₄C₃D₂E₁ ），在 28h 時0D_600nm 為1.279。

2.3搖瓶驗證試驗為確定貝萊斯芽孢桿菌20-10的最佳培養(yǎng)基配方比例，對正交試驗中的理論最優(yōu)組合和生長速度較快的2個試驗組合（試驗7和試驗8）分別采用搖瓶培養(yǎng)進行生長效果驗證。試驗以MY基礎培養(yǎng)基為對照，以有效活菌數(shù)作為評價標準，在 500mL 錐形瓶裝人液體培養(yǎng)基50mL ，添加 0.1% 碳酸鈣，菌株按 2% 接種于以上4種不同組合的培養(yǎng)基中，于 30% 、 180r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)^48，72h 測定發(fā)酵液 OD_600nm 并稀釋涂板計數(shù)。搖瓶培養(yǎng)重復3次。菌株20-10在4種不同組合培養(yǎng)基中的發(fā)酵水平如表4所示。

從表4可以看出，在3種優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h ，菌株20-10的菌體 0D_600nm 均比基礎培養(yǎng)基高，菌株在試驗7組合培養(yǎng)基中的菌體 0D_600nm 最大，為 30.74;48h 發(fā)酵液中有效活菌數(shù)以試驗7組合培養(yǎng)基最高，達到 19.7×10⁸CFU/mL ，明顯高于試驗8組合和正交理論最優(yōu)組合以及基礎培養(yǎng)基。在3種優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^72h ，菌株 20-10的菌體 ΔOD_600nm 、有效活菌數(shù)和細胞干重均比基礎培養(yǎng)基高，而且差異明顯；試驗7組合培養(yǎng)中獲得的菌體 0D_600nm 、有效活菌數(shù)和細胞干重均明顯高于試驗8組合和理論最優(yōu)組合， 0D_600nm 為33.89，有效活菌數(shù)達到了 45.5×10⁸CFU/mL ，干重為 0.51g/L ，比基礎培養(yǎng)基中的 ΔOD_600nm 、有效活菌數(shù)和干重分別提高了 31.51% 、106.82% 和 10.87% ，而且從成本上考慮，也比基礎培養(yǎng)基節(jié)約了更多生產(chǎn)原材料。因此，選擇正交試驗中試驗7組合A₂B₃C₄D₁E₂ 作為菌體20-10的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基各組分添加量為 20.0g/L 麥芽糖 ?10.0g/L 淀粉、 12.5g/L 酵母膏 ?1.0g/L 氯化鈉 、3.0g/L 硫酸銨

2.4菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗。

2.4.1.1接菌量。由圖4可知，當接菌量為 2.0% 時，有效活菌數(shù)最高，可達到 21.4×10⁸ CFU/mL。因此，選擇菌株20-10的液體發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)接菌量為 2.0% 。

2.4.1.2裝液量。由圖4可知，當裝液量為 50% 時，有效活菌數(shù)最高，可達到 18.3×10⁸CFU/mL 。因此，選擇菌株20-10的液體發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)裝液量為 50% 。

2.4.1.3轉速。由圖4可知，轉速影響菌株代謝，隨著轉速增加有效活菌數(shù)先增后減，趨勢明顯；當轉速為 200r/min 時，有效活菌數(shù)最高，可達到 15.3×10⁸CFU/mL ，有效活菌數(shù)均優(yōu)于其他處理。因此，選擇菌株20-10的液體發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)轉速為 200r/min 。

2.4.1.4溫度。由圖4可知，菌株20-10的液體發(fā)酵在 24～ 32% 均可生長繁殖，有效活菌數(shù)隨著溫度升高先增后減。當培養(yǎng)溫度為 30% 時，有效活菌數(shù)達到最高值，為 23.3× 10⁸CFU/mL 。因此，選擇菌株20-10的液體發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)溫度為 30^qC 。

2.4.1.5初始 pH 。由圖4可知，有效活菌數(shù)在初始pH為6.0～7.0 比較合適，其中當 pH 為7.0時，有效活菌數(shù)達到最高值，為 18.3×10⁸CFU/mL 。較低和較高pH都不太適合大量活菌產(chǎn)生。因此，選擇菌株20-10的液體發(fā)酵后續(xù)培養(yǎng)初始 pH 為7.0。

2.4.2響應面試驗。在單因素試驗結果基礎上，以對試驗結果影響最大的3個因素： pH（a） 、接種量（b）、溫度 （c） 為自變量，以有效活菌數(shù) （Y） 為響應值，用DesignExpert13.0軟件設計3因素3水平的響應面試驗，每個變量設置1個低水平和1個高水平，每組試驗重復3次，響應面試驗設計及結果如表5所示。

依據(jù)最小二乘法原理對表5試驗結果進行回歸分析，得到有效活菌數(shù)擬合方程：

Y=-182.34494+57.04361a-1128.08100b+3.67571c+ 78.150 00ab+0.480 65ac+64.737 50bc-5.193 46a² 一31 169.600 00b²-0.142 55c²

從表6可以看出，該回歸方程 P=0.000 1 ，說明該模型達到顯著水平；失擬項 P=0.0836gt;0.05 ，不顯著。由此可知，該回歸模型能夠準確模擬真實水平。其中，決定系數(shù) R²= 0.9933、校正決定系數(shù) R_Adj²=0.9846 ，說明回歸方程擬合程度高。

pH 、接種量、溫度交互作用對有效活菌數(shù)影響的響應曲面和等高線如圖5所示。由圖5可知， pH 與接種量對有效活菌數(shù)交互作用顯著（ Plt;0.05： ： pH 與溫度、接種量與溫度之間的交互作用對有效活菌數(shù)呈現(xiàn)出拋物面型關系，先上升后下降，所得到的響應面存在一個極大值點，說明 ΔpH 與溫度、接種量與溫度對有效活菌數(shù)交互作用極其顯著（ Plt;0.01 ），這與方差分析結果（表6）一致。

經(jīng)過響應面優(yōu)化，根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上有效活菌數(shù)最大時的培養(yǎng)條件： pH7.02321 、接種量 2.145% 、溫度 29.602 3°C 。

綜合單因素試驗和響應面試驗結果，菌株20-10生長的最佳條件為裝液量 50% 、接種量 2.0% 、初始 pH7.0 溫度30% 轉速 200r/min 。

2.5發(fā)酵罐小試和擴大培養(yǎng)以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對菌株20-10在 20L 發(fā)酵罐進行小試，并在 500L 發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，結果如表7所示。菌株20-10在 20L 發(fā)酵罐中發(fā)酵 64h 時發(fā)酵液的 OD_600nm 為20.55，有效活菌數(shù)為 52.0×10⁸CFU/mL ，而在 500L 發(fā)酵罐中發(fā)酵 64h 時發(fā)酵液的 0D_600nm 為36.78，有效活菌數(shù)為 160.5×10⁸CFU/mL ，說明該模型結果可靠，比在基礎培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵 72h 的有效活菌數(shù) （22.0×10⁸CFU/mL） 分別提高了1.36和6.30倍，提升效果最為顯著。20和 500L 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)與搖瓶發(fā)酵時間基本一致，因此，培養(yǎng)基優(yōu)化的效果可靠，可用于后期擴大生產(chǎn)。

3討論

高密度培養(yǎng)是貝萊斯芽孢桿菌工業(yè)化生產(chǎn)和應用的重要基礎。來源不同生境的不同微生物對營養(yǎng)物質及其環(huán)境要求不同，尋求經(jīng)濟且效果好的培養(yǎng)基成分對菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)至關重要。培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分包括碳源、氮源、無機鹽、微量元素等，碳源和氮源是菌體生長、增殖、代謝的主要影響物質，通常成分復雜的碳源或氮源的發(fā)酵有效活菌數(shù)較高。目前，貝萊斯芽孢桿菌液體發(fā)酵通常采用牛肉膏、酵母粉、蛋白脈、尿素等原料作為碳源和氮源[19-21]，該研究發(fā)現(xiàn)，在麥芽糖、淀粉和酵母膏作為主要成分的MY培養(yǎng)基中菌株20-10發(fā)酵液菌體濃度最高，顯著高于GYM培養(yǎng)基、GS培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基，與黎燕珊等[22]研究貝萊斯芽孢桿Ch-8采用麥芽糖為最佳碳源的結果類似。可能是麥芽糖、淀粉和酵母膏除了含有菌株20-10生長所需的碳源、氮源外，還含有適宜菌株20-10發(fā)酵的其他生長因子；而且復合型碳源可能更有利于貝萊斯芽孢桿菌營養(yǎng)需求。與前人所篩選的貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基原料相比[23-25]，麥芽糖和淀粉均為廉價的大宗農(nóng)副產(chǎn)品，具有簡單、易得、成本低等優(yōu)勢。微生物的生長和繁殖還需要一定的無機鹽離子，某些金屬離子（ ^′K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺， ）對芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成有顯著的促進作用。其中鈉離子對維持細胞滲透壓具有重要的作用，故在培養(yǎng)基中往往需要加入少量的鈉鹽。氯化鈉和硫酸銨也是價格相對低廉的化工原料，硫酸銨中含有S元素，是細菌蛋白質合成的主要原料，有利于促進細菌的生長和繁殖[26]，是合適的氮源選擇。以上材料來源廣泛且價格便宜，很適宜菌株20-10的擴大化和工業(yè)化生產(chǎn)。

菌株發(fā)酵過程較為復雜，選擇適合的試驗設計和優(yōu)化方法，確定發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化方案，是從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)的關鍵環(huán)節(jié)。目前常見的發(fā)酵優(yōu)化方法主要有單因素試驗、正交試驗和響應面試驗等分析方法[27]。其中正交試驗是一種簡單易行、經(jīng)濟實用的優(yōu)化試驗方法。該試驗通過單因素法篩選得到貝萊斯芽孢桿菌20-10的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為MY培養(yǎng)基，在此基礎上，通過96孔培養(yǎng)板結合正交試驗，篩選最佳培養(yǎng)基配方，得到各因素對貝萊斯芽孢桿菌20-10生長的影響從大到小依次為酵母膏 gt; 淀粉 gt; 麥芽糖。以正交試驗中發(fā)酵對數(shù)期 28h 的 0D_600nm 為評估標準，采用96孔板培養(yǎng)方式進行快速篩選，獲得了 最高組合試驗7、次高組合試驗8以及理論最佳組合，選定這3種優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎培養(yǎng)基進行比較，通過搖瓶發(fā)酵進行驗證，得到試驗7組合中菌株的 ΔOD_600nm 、有效活菌數(shù)和細胞干重最高，分別為 33.89、45.5×10⁸CFU/mL 和 0.51g/L 。以優(yōu)化后的MY培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，對接種量、發(fā)酵溫度 ?pH3 個顯著影響因素采用響應面法優(yōu)化菌株20-10的發(fā)酵條件，通過發(fā)酵罐小試和擴大培養(yǎng)驗證優(yōu)化后發(fā)酵水平，結果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基在 500L 發(fā)酵罐中 30^qC 培養(yǎng) 64h ，有效活菌數(shù)可達到160.5×10⁸CFU/mL ，比優(yōu)化前有效活菌數(shù)提高了6.30倍，而目前國內貝萊斯芽孢桿菌的平均發(fā)酵水平為 93.5×10⁸ CFU/mL，該研究發(fā)酵水平比目前平均發(fā)酵水平提高了 71.66% ，與近幾年一些研究者的發(fā)酵水平相比[19-26]，處于較高水平。該研究表明，培養(yǎng)基各組分添加量為 20.0g/L 麥芽糖、 10.0g/L 淀粉 .12.5g/L 酵母膏、 ?1.0g/L 氯化鈉 、3.0g/L 硫酸銨，選擇裝液量 50% 、接種量 2.0% 初始 pH7.0.30^°C 、轉速 200r/min 最有利于目標菌株的生長。由于96孔板裝液體積較小，加樣和混樣操作誤差受人為、移液槍、Tip頭影響較大，導致對最佳組合的評判存在一定的誤差，因此，在進行平行試驗時，需要注意加樣操作的嚴謹性，并用多次重復來保證結果的準確性。通過參照 Ω_0D600nm 從高到低的順序選擇組合以及理論最佳組合的方式，篩選出的培養(yǎng)基組合經(jīng)過多次驗證，結果均有較好的一致性，說明該方法可快速篩選出最適培養(yǎng)基成分碳源、氮源和無機離子的比例。

4結論

該研究通過單因素試驗、正交試驗，對菌株20-10培養(yǎng)基的組成和含量進行優(yōu)化后，確定了貝萊斯芽孢桿菌20-10的優(yōu)化培養(yǎng)基為 20.0g/L 麥芽糖、 10.0g/L 淀粉、 12.5g/L 酵母膏 ?1.0g/L 氯化鈉 ?3.0g/L 硫酸銨。通過響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，獲得菌株20-10的發(fā)酵條件：接種量為 2.0% 、發(fā)酵溫度為 30% 、pH為 7.0 。該研究為今后該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術參數(shù)和設計依據(jù)。

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