關鍵詞黃草烏；內(nèi)生菌;幼苗生長；促生效應中圖分類號S567.23獻標識碼A章編號 0517-6611（2025）14-0159-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.14.032

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ffects of Two Plant Growth-promoting Endophytic Bacteria on Seedling Growth of Aconitum vilmorinianum

WENRong23，HUANGZh-a，LIJn-zietal（1.ColegeofAgronomyand Biotechnogy，YuanAgriculturalUniversityKu ming，Yuan;YuanProvcialKeybatoyofdiciallantolog，YuangricuralUeityKug 650201;3.SouthesttioalandocalJtEgeigResearchCenterforeplasmIovtioandUilatioofCeseedicalaterials，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201）

AbstractObjective]Toexplorethegrowth-promotingefectoftwostrainsofedophyticbacteria（W4-1andW8-22）.Method]The experimentwasonducdinpots，witBacilussubtilisW4-1，aciluspumilusW-22，Controdsterileater（CK）asosiiotrol. Thethre straiswereccultuedwithA.lmorinianmsdingsfor50das，andgrowhidexes，ODandSOactivitisandcoet wereobservedtoalyeandcomparethgrowt-promotingefctsofthtwostrainsofylograssol.ResulteectsofstrainsW4-1 andW8-22oegowthofAvlmoriianmeedlingsweresimilartothoeofCotroltrain，othoftmcouldpromotetherowthofAil morinianumsedlings，ndtheirpromotionefectontheudergroundpartwasgreaterthanhatontheabove-groundpart；amongthe，compared with CK，the root weight of A . vilmorinianum seedlings of W4-1 and W8-22 increased significantly by 33.33% and 47.92% ，respectively，and the dry weight of leaves increased significantly by 62.50% and 50.00% ，respectively. The leaf SOD and POD activities increased，and theMDAcontentdereased，hilethclorophyllontentandsolublesugarcontenterelowertantoseofCK.Conclusion]edoptc bacteriastrainsW4-and-22othdaprootigetoAoriniasds，ndtestsacevedyai-2. However，furtereseachisededtoetenetrtereisocetratoectothgowthofimoiandingythe two strains.

Key Words Aconitum vilmorinianum;Endophytic bacteria;Seedling growth;Growth-promoting effect

黃草烏（Aconitum vilmorinianumKom.）為毛茛科（Ranun-culaceae）烏頭屬（Aconitum）多年生草本植物，是云南獨具特色的道地中藥材，其藥用部位為含多種活性有毒二萜生物堿的側生塊根，具有祛風散寒、活血止痛、解毒消腫等作用，是云南白藥氣霧劑、云南白藥膏、云南紅藥、百寶丹、無敵膏、虎力散等多種“云藥”重要原料。近年來，云南為解決野生資源銳減使其原料供不應求的局面，以滇中、滇東南、滇西北為主的高寒冷涼山區(qū)大力發(fā)展黃草烏種植，為市場提供所需原料。但在栽培中，大部分藥農(nóng)和藥企通常為自家留種與單作連年種植相結合，致使黃草烏出苗率低、幼苗病蟲害加重等，影響了藥材產(chǎn)量和品質。因此，如何利用黃草烏本身的潛在能力和內(nèi)生菌，提高黃草烏出苗率和成苗率、增強其抗病能力顯得尤為重要。

植物內(nèi)生菌是指可以生存于植物不同器官和組織的細胞間隙，這些內(nèi)生菌大多對植物有益，具有促進生長、降解有毒物質等化感作用，是目前兼有促生和生防的生物有機肥主要原料，這類內(nèi)生菌多數(shù)以芽孢桿菌和假單胞菌2種菌種為主[2-8]。例如棉花中接種 BHZ-28、SHE-24、SMT-24 內(nèi)生菌，促進了棉花的出苗率，提高了植株中SOD、POD、CAT等防御酶活性，降低了逆境傷害[9。這說明植物自身產(chǎn)生的內(nèi)生促生菌在其生長發(fā)育中扮演著重要的角色，但在黃草烏種子生產(chǎn)及種植中缺乏研究?；诖?，該研究利用前期從黃草烏塊根分離得到的2株內(nèi)生細菌菌株枯草芽孢桿菌（Bacilussubtilis）W4-1短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）W8-22，以綠隴生物科技有限公司研發(fā)的枯草芽孢桿菌菌劑為陽性對照，通過盆栽試驗，探究2株黃草烏促生內(nèi)生細菌對其幼苗生長的影響，為進一步提高黃草烏出苗率、成苗率、成活率提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗地點種子催芽、煉苗及接種菌種地點在云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)科專業(yè)基礎實驗教學中心。菌株擴繁地點在云南農(nóng)業(yè)大學西南中藥材種質創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心。

1.2 試驗材料

1.2.1黃草烏種子。選用全省種植面積最多的“滇草烏1號”品種的實生種，該實生種來源于云南省昆明市祿勸縣撒營盤鎮(zhèn)書西村委會干海子村（海拔 2466m，102^°56^′E，25^°94^′N） 當年收獲的種子。

試驗前，先挑選出顆粒飽滿的種子，將其置于 3‰ 的高錳酸鉀溶液中消毒，并用無菌水反復漂洗以去除殘留的高錳酸鉀溶液，吸干表面水分后置于2層濾紙的培養(yǎng)血中，用 4mL 濃度為 10^-7mg/L 的NAA濕潤濾紙片，放入 20% 的光照培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)7d進行種子催芽。待種子萌發(fā)后，選擇胚芽長度達到種子直徑的 50% 且胚根與種子直徑等長的黃草烏幼苗，將其移栽至裝有 25g 無菌基質土（草炭土、蛭石、珍珠巖按照 3：1：1 比例混勻）的紙杯中（直徑為 8cm ），放于室內(nèi)種植。后續(xù)生長過程中，澆水、施肥等管理措施均保持一致。直到黃草烏幼苗長出2片真葉時進行后續(xù)處理

1.2.2 供試菌株及培養(yǎng)條件。

1.2.2.1供試菌株。從黃草烏塊根中分離得到2株內(nèi)生細菌菌株，經(jīng)16SRNA測序并在NCBI上比對，確定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）W4-1（簡稱W4-1）短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）W8-22（簡稱W8-22），對照菌株選購目前生產(chǎn)上應用較多的且由綠隴生物科技有限公司生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌劑（可濕性粉劑，濃度為 5g/L ）。

1.2.2.2培養(yǎng)條件。以LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白肺 10g 、酵母浸粉 5g 氯化鈉 10g 蒸餾水 1000mL ）于 37^°C 條件下恒溫培養(yǎng)。用于后續(xù)試驗的對照菌劑（枯草芽孢桿菌），接種時按該菌劑的使用說明配制。

1.3 試驗方法及觀測指標

1.3.1黃草烏幼苗菌株接種方法。將菌株 W4-1，W8-22 接種至裝有 100mL 無菌LB培養(yǎng)液中，置于 37°C，130r/min 的恒溫搖床中過夜培養(yǎng)， 24h 后將培養(yǎng)菌液取出，以 5000r/min 、4^°C 離心 3min ，去除培養(yǎng)液后用 0.9% 的生理鹽水將菌體沉淀重懸，用分光光度計測定其 0D₆₀₀ 值并將其調(diào)整至菌量濃度約為 1×10⁸CFU/mL 的菌懸液備用。同時，選取含2片真葉且長勢無明顯差異的黃草烏幼苗作為供試材料，將其隨機分為4組，每組含15株苗，設置如下4個處理： 1 W "4 - 1"處理，接種W4-1的菌懸液 2mL 盆至黃草烏幼苗根際土壤; 2 W 8 - 2 2"處理，接種W8-22的菌懸液 2mL 盆至黃草烏幼苗根際土壤； ③ 陽性對照（Control），將商品化的枯草芽孢桿菌菌劑按使用說明稀釋至菌量濃度約 1×10⁸CFU/mL 后取2mL 接種于黃草烏幼苗根際作為陽性對照； ④ 陰性對照（CK），施用等體積的無菌水。初次處理后每間隔7d按上述方法對黃草烏幼苗灌根處理1次，持續(xù)處理3次后，培養(yǎng)50d，取出黃草烏幼苗，測定相關數(shù)據(jù)。整個期間的光照、溫濕度及水肥管理等各處理均保持一致。

1.3.2黃草烏幼苗生長指標及觀測方法。

（1）生長指標。將上述處理后生長 50d 的黃草烏幼苗挖出，隨機取出5株用于生長指標的測定。用清水洗凈其根部泥土，吸干水分后測量黃草烏幼苗的株高、葉片鮮重、葉片干重、根重、須根數(shù)和根長，將其裝入牛皮紙袋中，放入 60^°C 烘箱 24h 后再以 45^°C 烘干至恒重，測定其整株干重。

（2）葉綠素含量。隨機取黃草烏幼苗5株，剪下葉片，放入小燒杯中，蒸餾水沖洗3次，用無菌吸水紙吸干表面水分，去葉脈后將其剪碎并混勻，稱取 0.100g 置于干凈的研缽中，加人少量 95% 乙醇溶液并將其充分研磨均勻，將全部研磨液轉移至 10mL 的容量瓶中用 95% 的乙醇定容，于黑暗條件下靜置5d，至底部組織殘渣完全變白，用分光光度計測定665和 649nm 處的吸光度A，并通過以下公式計算葉綠素含量。

葉綠素含量 =6.63×A₆₆₅+18.08×A₆₄₉×V×D/（1000×W） 式中： V 為提取液體積（ 10mL ： D 為稀釋倍數(shù)（未作稀釋即為1）; W 為樣本質量 （0.1g） 。

（3）可溶性糖含量。參照祝義偉等[]、楊勤等[]的方法測定黃草烏幼苗干樣葉片中的可溶性糖含量。

1.3.3黃草烏幼苗逆境生理指標的測定。通過觀測超氧化物歧化酶（SOD）過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量，判斷供試菌劑影響黃草烏幼苗抗性的生理指標。隨機取5株黃草烏幼苗，將葉片洗凈吸干表面水分，剪碎混勻后稱取 0.100g ，放入冰凍好的研磨缽中，研磨至均漿為粗酶提取液，將粗酶提取液均勻分成3份后按試劑盒（SOD和MDA試劑盒均購自蘇州銳思生物有限公司；POD試劑盒購自北京Biobox生物科技有限公司）的說明標準進行操作。采用分光光度法測定SOD和POD的活性以及MDA含量。

1.4數(shù)據(jù)處理用SPSS、Excel2016和Word2016等進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析、繪圖，采用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.12株黃草烏內(nèi)生細菌促生生物學活性檢測將2株內(nèi)生細菌W4-1和W8-22分別接種于低氮固體培養(yǎng)皿、解鉀固體培養(yǎng)皿、溶磷固體培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，培養(yǎng)14d后，發(fā)現(xiàn)W8-22菌株具有固氮和解鉀作用，W4-1菌株只有解鉀作用（表1）；進一步加入顯色劑顯色，2株菌株均未出現(xiàn)淡粉紅色，表明2株菌株均無產(chǎn)IAA能力（表1）。說明2株菌株均有一定的促生作用，W8-22菌株促生能力更強一些。

2.22株黃草烏內(nèi)生細菌對其幼苗生長的影響W8-22、W4-1和Control處理菌株與黃草烏幼苗共培養(yǎng) 50d 時，觀測幼苗生長的情況，見圖1。與CK相比， W8-22，W4-1 和Con-trol均促進了根系的縱向生長，根長從大到小依次為 W8-22gt;Controlgt; _W4-1gt;CK 。對地上部分的影響，除葉色有差異外，烏的促生作用與Control相似，均表現(xiàn)為對地下部分的促進

從表2可以看出，株高除W4-1顯著低于CK外，其他處理間差異不顯著；與CK相比， W8-22，W4-1 和Control葉片干重分別提高了 50.00%.62.50%.37.50% ，干重從大到小依次為 W4-1gt;W8-22gt; Control ，W4-1促進效果最顯著；根重從大到小依次為 Control gt;CK ，前3個處理根重分別比CK顯著提高了 47.92%.33.33%.31.25% ，但3個菌處理之間差異不顯著；須根數(shù)量從多到少依次為Con-t ，前3個處理須根數(shù)量分別比CK增加了 58.09%.39.06%.28.57% ，但3個處理間差異不顯著。這說明2株黃草烏內(nèi)生菌W4-1和W8-22均具有促進作用，其中W4-1不僅促進地上部葉片生長，還能促進根系生長，而W8-22對株高和根系生長均具有促進作用。

2.32株黃草烏內(nèi)生菌對其幼苗葉綠素含量和可溶性糖含量的影響對不同處理的黃草烏幼苗葉綠素含量和可溶性糖含量進行測定和比較，結果如圖2所示。與CK相比，W4-1、W8-22和Control的葉綠素含量顯著降低，但3個菌株處理間差異不顯著；可溶性糖含量從大到小依次為CKgt;Controlgt;W8-22gt;W4-1 ，W4-1和W8-22均顯著低于Control處理。這說明2株黃草烏內(nèi)生菌對葉綠素含量和可溶性糖含量的促進作用不明顯。

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（ 。Note：Different lowercase letters in the same column indicate significantdifference（ _Plt;0.05） 二

注：不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 。

Note：Different lowercaselettersindicate significant difference（ Plt;0.05） ：

Fig.2Efects of different treatments onchlorophyllcontent and soluble sugar content inA.vilmorinianumseedlings

2.4不同處理對黃草烏幼苗葉片抗性能力的影響對黃草烏幼苗葉片中的SOD、POD活性和MDA含量進行檢測，結果見圖3。與CK相比，SOD和POD的活性變化趨勢一致，均為 W8-22gt;Controlgt;W4-1gt;CK，SOD.POD 活性最高的均為W8-22，分別達 5.39.95.67U/g ，其活性顯著高于其他3個處理；與CK相比，3個菌株處理MDA含量均低于CK。說明黃草烏內(nèi)生菌W4-1和W8-22均能提高幼苗中的SOD和POD活性、降低幼苗膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量，從而提高幼苗生長的抗性，其效果最好的為W8-22菌株。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference（ Plt;0.05） ！

3討論與結論

該試驗基于目前黃草烏種植產(chǎn)業(yè)中存在的問題出發(fā)，以綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展理念為基礎，以提高黃草烏出苗率、成苗率及抗性為目標，選取了前期分離并鑒定的2株黃草烏內(nèi)生細菌W4-1和W8-22與目前市場上應用較多的枯草芽孢桿菌菌劑（購買于綠隴生物科技有限公司，為綠隴品牌）進行比較，開展黃草烏促生菌的促生效應研究。為了驗證內(nèi)生菌的生物學功能，該研究采用目前廣泛應用的內(nèi)生菌與研究植株共培養(yǎng)方法，觀測促生菌對黃草烏生長和生理的影響，以期為進一步利用2株黃草烏促生內(nèi)生細菌提供理論依據(jù)。

在植物內(nèi)生菌促進幼苗生長方面，遲惠榮等[12]在多花黃精中施加多花黃精的內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌ZJU-3增長了根長和根數(shù)；陳國軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)促生細菌芽孢桿菌能提高幼苗的鮮重和干重；Lakshmanan等[14]研究表明，擬南芥用枯草芽孢桿菌FB17處理后，根系在定殖過程中表達了多個與涉及代謝、脅迫反應和植物防御的相關基因而提高了抗性；周向平等[15]研究表明接種促生菌可以顯著增加SOD、POD的活性，提高煙草幼苗抗青枯病的能力。該研究表明，黃草烏內(nèi)生促生細菌W8-22和W4-1菌株對黃草烏幼苗生長的影響與枯草芽孢桿菌相似，2株菌株主要是促進了幼苗地下部根系生長、提高了地上部葉片中SOD和POD活性、降低了幼苗中MDA含量，均表現(xiàn)出促進黃草烏幼苗生長的作用，其中，促生效果最好為W8-22菌株；但2株菌株對黃草烏幼苗生長的影響是否存在濃度效應還需進一步研究。

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