摘" 要：轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命活動的重要調(diào)控方式之一。天然橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，主要來源于橡膠樹。天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是近年來橡膠樹基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點之一。焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MVD）是天然橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵酶，目前對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚不清楚。本研究克隆了長度為1500 bp的橡膠樹HbMVD1啟動子，序列分析顯示其含有茉莉酸響應(yīng)、乙烯響應(yīng)、機(jī)械傷害響應(yīng)、光響應(yīng)、MYC結(jié)合等順式作用元件。自激活抑制梯度試驗顯示，AbA濃度為100 ng/mL時，pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的轉(zhuǎn)錄自激活得到有效抑制。利用酵母單雜交技術(shù)從橡膠樹膠乳酵母cDNA文庫共篩選到13個與HbMVD1啟動子結(jié)合的非冗余蛋白，包括1個WRKY轉(zhuǎn)錄因子（HbWRKY1）、1個熱激轉(zhuǎn)錄因子、1個G-box結(jié)合因子。組織特異性分析顯示這些蛋白的編碼基因在不同組織間存在不同的表達(dá)模式。轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析顯示HbWRKY1在體內(nèi)可以激活HbMVD1基因的表達(dá)。分子對接發(fā)現(xiàn)，HbWRKY1與HbMVD1啟動子的機(jī)械傷害響應(yīng)元件結(jié)合，并鑒定到11個潛在的氨基酸結(jié)合位點。本研究為進(jìn)一步揭示橡膠樹HbMVD1轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；HbMVD1啟動子；酵母單雜交；轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控中圖分類號：S794.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning of the"HbMVD1"Gene Promoter and Screening of Transcription Regulatory Factors in Rubber Tree

WEN Lianxuan^1，2， YANG Shuguang¹， SHI Minjing¹， DENG Xiaomin^1，3， CHAO Jinquan^1，3*

1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Biology amp; Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Graduate School， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100081， China; 3. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572024， China

Abstract："Transcriptional regulation is one of the pivotal mechanisms governing biological activities. Natural rubber （NR）， a crucial industrial raw material， is predominantly derived from rubber trees. The transcriptional regulation of NR biosynthesis has emerged as a focal point in the fundamental research of rubber tree in recent years. Mevalonate diphosphate decarboxylase （MVD） is a key enzyme in the biosynthetic pathway of NR， yet its transcriptional regulation remains poorly understood. In this study， a 1500 bp promoter region of the"HbMVD1"gene from rubber tree was cloned. Sequence analysis revealed the presence of various"cis-acting elements， including the responsive to jasmonic acid， ethylene， mechanical wounding， light， and MYC binding. A gradient assay for autoactivation suppression demonstrated that the transcriptional autoactivation of the pAbAi-pHbMVD1 bait vector was effectively inhibited at an AbA concentration of 100 ng/mL. 13 non-redundant proteins from a rubber tree latex yeast cDNA library that interact with the"HbMVD1"promoter， including one WRKY transcription factor （HbWRKY1）， one heat shock transcription factor， and one G-box binding factor were identified utilizing yeast one-hybrid screening. Tissue-specific expression analysis indicated that the genes encoding the proteins exhibited distinct expression patterns across different tissues. Transcriptional regulation analysis showed that HbWRKY1 activated the expression of"HbMVD1 in vivo. Molecular docking revealed that HbWRKY1 bound to the mechanical wounding element of the"HbMVD1"promoter， and 11 potential amino acid binding sites were identified. This study would lay the groundwork for further elucidating the transcriptional regulatory network of"HbMVD1"in rubber tree.

Keywords："rubber tree;"HbMVD1"promoter; yeast one-hybrid library; transcription factor; transcriptional regulation

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.001

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命活動的重要調(diào)控方式之一，是指在轉(zhuǎn)錄過程中通過一系列復(fù)雜的機(jī)制對基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控^[1]。轉(zhuǎn)錄因子是執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要成員。轉(zhuǎn)錄因子通過識別并結(jié)合到DNA上的順式作用元件，激活或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物體的生長發(fā)育、響應(yīng)各種外界刺激以及自身生理反應(yīng)等生物學(xué)過程^[2]。酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid method，Y1H）是將順式作用元件序列和編碼轉(zhuǎn)錄因子的序列分別構(gòu)建到含報告基因及激活結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)化酵母觀察是否啟動下游報告基因的表達(dá)來確定轉(zhuǎn)錄因子是否和順式作用元件結(jié)合^[3]。目前Y1H已是篩選鑒定與順式作用元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的常用技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。如余婧等^[4]利用Y1H從煙草酵母cDNA文庫中篩選到與NtCBT基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子ANL2、ML1及NF-YA3；CAO等^[5]利用Y1H從百合酵母cDNA文庫中篩選到與LhMYBSPATTER基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子ERF4和MYB4，并利用熒光素酶實驗系統(tǒng)證明MYB4對LhMYBSPATTER基因的表達(dá)起激活作用而ERF4對LhMYBSPATTER基因的表達(dá)起抑制作用。

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，主要來源于橡膠樹。與人工合成橡膠相比，天然橡膠具有良好的絕緣性、耐磨性和抗拉性，被廣泛運用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、國防建設(shè)、交通運輸、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，在國計民生中發(fā)揮著不可替代的作用^[6-7]。天然橡膠本質(zhì)是高分子聚異戊二烯鏈，分子量可達(dá)數(shù)百萬道爾頓。自然界中存在2種主要的異戊二烯焦磷酸（isoprene pyrophosphate， IPP）合成途徑：甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（2-methyl-D-erythr-itol-4-phosphate， MEP）途徑，其中MVA途徑與橡膠樹中的天然橡膠生物合成密切相關(guān)。MVA途徑以乙酰輔酶A為底物，經(jīng)過6步酶促反應(yīng)最終形成IPP。焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（meva-lonate-5- pyrophosphate decarboxylase， MVD）催化MVAPP脫去1分子的CO₂和H₂O形成IPP，是MVA途徑關(guān)鍵酶之一^[8-11]。1971年SKILLETER等^[12]從橡膠樹膠乳中成功純化MVD蛋白，并對其酶學(xué)活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其活性與膠乳代謝存在顯著正相關(guān)。但有關(guān)MVD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究尚無報道。本研究克隆了橡膠樹HbMVD1的啟動子，通過篩選膠乳酵母cDNA文庫，得到13個與HbMVD1啟動子結(jié)合的蛋白，包括3個轉(zhuǎn)錄因子。本研究為進(jìn)一步揭示天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1" 材料

橡膠樹無性系熱研8-79定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州基地。橡膠樹熱研8-79膠乳酵母cDNA文庫為本課題組保存。多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；平末端克隆試劑盒（pEASY?-Blunt Cloning Kit）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；膠回收試劑盒（FastPureGel DNA Extraction Mini Kit）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；同源重組試劑盒（ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；酵母菌株Y1H Gold、農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑及生化試劑均為國產(chǎn)超純和分析純。

1.2""方法

1.2.1 "橡膠樹基因組DNA提取" 取橡膠樹熱研8-79幼嫩葉片，液氮研磨后根據(jù)多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整度檢測。

1.2.2""HbMVD1啟動子克隆及順式作用元件預(yù)測" 從橡膠樹熱研8-79基因組數(shù)據(jù)中獲取HbMVD1基因的啟動子序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計克隆HbMVD1啟動子的上游引物（proHbM-VD1-F：TGTAGCATTGATGCAGCTT）和下游引物（proHbMVD1-R：TACAGCAAGCAACACAC CA）。以橡膠樹熱研8-79基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：DNA模板1"μL，2×PrimeSTAR mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1"μL，超純水22"μL。反應(yīng)程序為：95"℃ 3"min；95"℃ 30"s，56"℃ 30"s，72"℃ 30"s，35個循環(huán)；72"℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收連接至pEASY-Blunt克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，過夜培養(yǎng)后挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。將測序正確的HbMVD1啟動子（proHbMVD1）序列提交至PlantCARE（http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.3 "pAbAi-pHbMVD1誘餌載體構(gòu)建" 以測序正確的pEASY-proHbMVD1質(zhì)粒為模板，用攜帶pAbAi載體同源臂的引物pHbMVD1-F（AAGC TTGAATTCGAGCTGTAGCATTGATGCAGCTT）和pHbMVD1-R（ACAGATCCCCGGGTACCGAT ACAGCAAGCAACACAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段，通過ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit同源重組方法將片段構(gòu)建至pAbAi載體獲得pAbAi-pHbMVD1誘餌載體，并以pHbMVD1-F端引物和pAbAi載體通用R端引物（CCATCTCGAA AAAGGGTTTGCC）對重組載體進(jìn)行PCR驗證。

1.2.4" 最低AbA濃度測定 "將pAbAi-pHbMVD1誘餌載體和pAbAi-p53陽性對照載體線性化，分別轉(zhuǎn)化酵母Y1H Gold感受態(tài)細(xì)胞并涂布于SD/-Ura固體培養(yǎng)基，30"℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d。分別挑選陽性菌落，經(jīng)無菌水稀釋后涂布到SD/- Ura、SD/-Ura/AbAi（100 ng/mL）、SD/-Ura/AbAi（150 ng/mL）、SD/-Ura/AbAi（200 ng/mL）的固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察平板上菌落的生長情況。

1.2.5" 酵母單雜交cDNA文庫篩選" 從SD/-Ura平板上挑取含pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的Y1H Gold單菌落，接種于5 mL SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30"℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h至飽和。取1 mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30"℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5。室溫下1000×g離心5 min收集菌體，用25 mL無菌水洗滌并重懸于1"mL 1.1×TE/LiAc緩沖液（10"mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L LiAc， pH 7.5）。取50"μL含pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的Y1H Gold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入：2 μg膠乳酵母cDNA文庫質(zhì)粒DNA、10 μL鮭精DNA（10 mg/mL，預(yù)先煮沸5 min后冰浴）、500 μL PEG/LiAc溶液（40% PEG4000、100 mmol/L LiAc、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA， pH 7.5）輕柔混勻后于30"℃水浴孵育30 min。加入20 μL DMSO（終濃度為7%），42"℃熱激15 min。室溫下1000×g離心5 min，棄上清，菌體用1 mL YPDA重懸。30"℃、250 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)1 h。將復(fù)蘇培養(yǎng)物1000×g離心5 min，菌體用100 μL無菌水重懸。取10 μL涂布于SD/-Ura-Leu/AbA（100 ng/mL）篩選平板，30"℃倒置培養(yǎng)3～5 d。待陽性克隆菌斑直徑達(dá)1～ 2"mm時，挑取單菌落至新鮮SD/-Ura-Leu/AbA平板進(jìn)行二次篩選。以含pAbAi-p53與pGADT53m的酵母菌株為陽性對照，含pAbAi-pHbMVD1與pGADT53m的酵母菌株為陰性對照。pGADT53m載體為課題組保存。

1.2.6" 陽性克隆測序 "將陽性菌落接種于SD/- Ura-Leu/AbAi的液體培養(yǎng)基，30nbsp;℃搖床震蕩培養(yǎng)。以pGADT7載體測序引物（F： TAATACGAC TCACTATAGGGC; R： TAAGAGTCACTTTAAAA TTTGTAT）進(jìn)行菌液PCR，取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，挑選條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.7" 表達(dá)譜數(shù)據(jù)提取" 從國家基因組數(shù)據(jù)中心下載橡膠樹形成層、樹皮內(nèi)層、初生膠乳、次生膠乳、雌花、雄花、葉片等7個組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)序列號為PRJCA004986。利用Tophat程序，將所下載數(shù)據(jù)與橡膠樹熱研8-79基因組序列進(jìn)行比對，根據(jù)Cufflink程序完成基因的相對表達(dá)（FPKM）值計算。提取目的基因?qū)?yīng)的FPKM值，經(jīng)log₂轉(zhuǎn)換后通過Genesis軟件進(jìn)行表達(dá)熱圖繪制。

1.2.8 "轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析" 以特異引物0800-F（GG GCGAATTGGGTACCTGTAGCATTGATGCAGCTT）和0800-R（AGGAATTCGATATCAAGCTTTAC AGCAAGCAACACACCA）擴(kuò)增pEASY-proHbM VD1質(zhì)粒，以特異引物2300-F（GACAGGGTA CCCGGGGATCCATGACTTCCAAAGTTCTC）和2300-R（ACCATGGTACTAGTGTCGACTTAGCT TTGGACAGGCTCTGC）擴(kuò)增含HbWRKY1基因的陽性酵母菌。參照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit同源重組試劑盒操作說明書，將擴(kuò)增片段分別連入pGreenⅡ0800-LUC載體和pCAM-BIA2300載體，獲得pGreenⅡ0800-proHbMVD1： LUC和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體。將測序正確的pGreenⅡ0800-proHbMVD1-LUC和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體，以及pCAMBIA2300空載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，挑選單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（30"℃，220 r/min）。離心收集菌體并用YEP液體培養(yǎng)基重懸，按試驗組（pGreenⅡ0800-"proHbMVD1-LUC∶pCAMBIA2300-HbWRKY1= 1∶1）和對照組（pGreenⅡ0800-proHbMVD1- LUC∶pCAMBIA2300=1∶1）進(jìn)行菌液混合并調(diào)整至OD₆₀₀=0.6，通過注射法注射煙草葉片。注射后的煙草暗培養(yǎng)48 h后噴施D-熒光素鉀鹽溶液，置于Princeton公司的活體植物發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：LumaZonepylon 2048B）中觀察。

1.2.9" 互作位點分析 "通過HelixFold3（https：// paddlehelix.baidu.com/？redirect=console）在線軟件

分析HbWRKY1與不同順式作用元件之間的相互作用，并進(jìn)一步利用PyMOL3.1軟件（Schr?dinger，美國）展示互作的氨基酸位點。

2" 結(jié)果與分析

2.1""HbMVD1啟動子克隆及順式作用元件分析

提取橡膠樹熱研8-79基因組DNA作為模板，以HbMVD1啟動子引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序分析，成功獲得長度為1500 bp的HbMVD1啟動子序列（圖1A）。將序列提交至PlantCARE在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，HbMVD1啟動子除了常見的TATA-box和CAAT-box等核心元件外，還含有茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）、器械傷害響應(yīng)元件（WUN-motif）、MYC結(jié)合元件（MYC）、光響應(yīng)元件（Box 4）等（圖1B）。

2.2" pAbAi-pHbMVD1誘餌載體構(gòu)建

通過同源重組方式將HbMVD1構(gòu)建至pAbAi得到pAbAi-pHbMVD1誘餌載體，利用HbMVD1啟動子F端引物和pAbAi載體通用R端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，結(jié)果顯示可以擴(kuò)增出1685 bp目的片段（1500 bp+185 bp），而以空載體為模板未擴(kuò)增出目的條帶（圖2）。

2.3" AbA最小抑制濃度確定

取轉(zhuǎn)化pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的YIH Gold酵母菌株涂布于不同濃度AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基上，以含p53-AbAi載體的YIH Gold酵母菌株為陽性對照。結(jié)果顯示，p53-AbAi陽性對照菌株在AbA濃度為200 ng/mL時生長被抑制，而pAbAi-pHbMVD1測試菌株在AbA濃度為100 ng/mL時生長就被抑制（圖3），因此AbA最小濃度為100 ng/mL。

2.4""酵母單雜交文庫篩選

將膠乳cDNA文庫轉(zhuǎn)化至含有pAbAi-"pHbMVD1的酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于多個SD/- Ura-Leu篩選平板進(jìn)行文庫篩選（圖4A），并將候選陽性克隆進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至新的SD/-Ura-Leu篩選平板培養(yǎng)，最終得到34個陽性克隆，編號P1～P34（圖4B）。

2.5""克隆測序結(jié)果分析

將獲得的34個陽性克隆經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對后共得到13個可能與HbMVD1啟動子結(jié)合的蛋白，包括注釋為磷脂酶（Hb15g055630）、細(xì)胞分裂周期因子

（Hb07g037490）、生長素抑制蛋白（Hb04g-047470）、小分子熱休克蛋白（Hb04g052040）、蛋白酶抑制劑蛋白（Hb06g002380）、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Hb07g028960）、磷脂酸磷酸酶（Hb07 g032180）、鐵硫簇組裝酶（Hb07g037260）、F-box蛋白（Hb12g001190）、橡膠延伸因子（Hb12 g002580）等10個蛋白。此外，還篩選到3個潛在轉(zhuǎn)錄因子，分別是Hb18g010770（WRKY轉(zhuǎn)錄因子）、Hb13g050000（G-box結(jié)合因子）、Hb16 g003060（熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子）（表1）。

2.6""組織特異性表達(dá)分析

利用課題組保存的7個橡膠樹組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析13個蛋白編碼基因的組織特異性（圖5）。結(jié)果顯示，Hb15g055630和Hb07g037260在7個組織中均高豐度表達(dá)，Hb06g002380在7個組織中的表達(dá)豐度很低甚至不表達(dá)，Hb07g037490和Hb12g001190在膠乳中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織。此外，Hb13g050000、Hb07g028960、Hb12g 002580、Hb16g003060在開割膠乳中的表達(dá)量高于初生膠乳。

2.7" HbWRKY1對HbMVD1啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析及互作位點鑒定

Blast比對分析顯示，Hb18g010770序列與前人報道的橡膠樹HbWRKY1完全一致。為鑒定HbWRKY1對HbMVD1啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，將攜帶proHbMVD1-0800重組載體（含熒光素酶報告基因）和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體的農(nóng)桿菌注射煙草葉片?；铙w成像分析顯示，與空載組相比，HbWRKY1組熒光信號顯著增強(qiáng)（圖6A），表明HbWRKY1可以在體內(nèi)激活HbMVD1啟動子的表達(dá)。

為進(jìn)一步解析HbWRKY1與HbMVD1啟動子的結(jié)合位點，本研究利用HelixFold3分析HbMVD1啟動子上不同順式作用元件與HbWRKY1間的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)僅WUN-motif與HbWRKY1存在相互作用，且在2埃距離范圍內(nèi)鑒定到11個與WUN-motif互作的氨基酸：Gln-101、Asn-224、Gly-292、Gly-396、Trp-405、Asn-406、Ser-409、Arg-433、Ser-434、Val-448和Ile-449（圖6B）。

3""討論

天然橡膠的生物合成大致可分為MVA途徑的IPP合成（pre-IPP）和橡膠鏈的聚合延伸（post-IPP）2個階段^[13]。近年來天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是橡膠樹基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點之一，先后有多個轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能得到揭示，如HbMYC2結(jié)合并激活HbSRPP和HbFPS基因的啟動子、HbCZF1結(jié)合并激活HbHMGR基因的啟動子、HbMADS4結(jié)合并抑制HbSRPP基因的啟動子等^[14-16]。MVD是橡膠生物合成途徑關(guān)鍵酶之一，目前對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚無報道。本研究克隆了橡膠樹HbMVD1啟動子序列，并通過酵母單雜交文庫篩選獲得了3個與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子成員。

編碼G-box結(jié)合因子的Hb13g050000屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。bZIP是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其特征是bZIP結(jié)構(gòu)域高度保守^[17]。前人研究顯示，bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以與ABRE、H-box、G-box、GLM、ACE等順式作用元件相結(jié)合，廣泛參與植物的生長發(fā)育及逆境脅迫等生物學(xué)過程^[18]。有研究表明bZIP也參與植物次生代謝物的合成調(diào)控，刺五加的3個bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以與刺五加皂苷合成關(guān)鍵基因（EsFPS，"EsSS，"EsSE）啟動子結(jié)合并激活其表達(dá)^[19]；擬南芥的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5可以結(jié)合萜類合成關(guān)鍵基因AtTPS03的啟動子并激活其表達(dá)^[20]。作為高分子萜類化合物，天然橡膠的合成途徑屬于典型的次生代謝。G-box結(jié)合因子的鑒定為深入研究HbMVD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor， HSF）是植物中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)可以分為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、寡聚化結(jié)構(gòu)域、核定位信號、核輸出信號和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等5個部分，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過與啟動子上的順式作用元件結(jié)合，廣泛調(diào)控植物對多種非生物脅迫尤其是低溫/高溫脅迫的響應(yīng)^[21]。在橡膠樹中，李言等^[22]分析了30個HbHSF家族成員在低溫脅迫下抗寒品種和不抗寒品種中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)有5個成員在抗寒品種中的表達(dá)量顯著高于不抗寒品種。有研究表明HSF也參與植物次生代謝物的合成調(diào)控。KUMAR等^[23]將HvHSFA2e基因在大麥中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的黃酮和萜類代謝主要基因的表達(dá)量顯著上調(diào)；ZHANG等^[24]發(fā)現(xiàn)茶樹的CsHSFA1b和CsHSFA2可以通過激活茉莉酸途徑抑制因子CsJAZ6的表達(dá)進(jìn)而減少兒茶素的積累。本研究鑒定到1個HSF成員與HbMVD1啟動子結(jié)合，為進(jìn)一步解析HSF對天然橡膠的調(diào)控機(jī)制提供新的思路。

WRKY是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其特征是含有1～2個高度保守的WRKYGQK基序以及1個鋅指基序^[25]。通過與啟動子序列上的順式作用元件結(jié)合，WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育以及響應(yīng)生物/非生物脅迫的生物學(xué)過程^[26]。前人從橡膠樹基因組中鑒定到81個HbWRKY成員，其中HbWRKY27結(jié)合并激活HbFPS基因的啟動子，HbWRKY1結(jié)合并抑制HbSRPP基因的啟動子^[27-29]。本研究通過酵母單雜交篩庫發(fā)現(xiàn)HbWRKY1也可以結(jié)合HbMVD1啟動子，進(jìn)一步的活體成像試驗證明HbWRKY1可以激活HbMVD1啟動子的表達(dá)?；贛VD是pre-IPP階段關(guān)鍵酶而SRPP是post-IPP階段的關(guān)鍵酶，推測HbWRKY1在天然橡膠生物合成的不同階段起不同的調(diào)控作用，這可能是一種精細(xì)的調(diào)控模式，進(jìn)而控制天然橡膠的生物合成。

轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子區(qū)域的靶向順式作用元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)控功能基因的表達(dá)。本研究對HbMVD1啟動子序列分析鑒定到多個順式作用元件，如CGTCA-motif、ERE、WUN-motif、MYC、ARE等。分子對接發(fā)現(xiàn)僅WUN-motif與HbWRKY1存在互作，且在2埃范圍內(nèi)鑒定到11個潛在的互作氨基酸。WUN-motif是一種與傷害反應(yīng)相關(guān)的作用元件，通過響應(yīng)機(jī)械傷害來激活目標(biāo)基因的表達(dá)^[30]。在生產(chǎn)中，割膠是收獲橡膠樹天然橡膠的唯一方式。割膠不僅可以提高天然橡膠合成效率，還可以激活橡膠合成相關(guān)基因如HbMVD1等的表達(dá)^[16]?？紤]到割膠也是一種嚴(yán)重的機(jī)械傷害，推測割膠后HbWRKY1可能通過與HbMVD1啟動子上的WUN-motif順式作用元件結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)天然橡膠的生物合成。

參考文獻(xiàn)

1. 付蕓， 何銘， 徐建飛， 張姣姣， 卞春松， 胡軍， 李廣存， 金黎平. 光周期調(diào)控馬鈴薯塊莖初始形成關(guān)鍵時期的轉(zhuǎn)錄組分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2024， 47（4）： 45-56.Fu Y， He M， Xu J F， Zhang J J， BiaN C S， Hu J， Li G C， Jin L P. Transcriptome analysis of tuber initiation of"Solanum tuberosum"regulated by photoperiod[J]. Journal of Hebei Agricultural University， 2024， 47（4）： 45-56. （in Chinese）
2. Francois M， Donovan P， Fontaine F. Modulating transcription factor activity： interfering with protein-protein interaction networks[J]. Seminars in Cell and Developmental Biology， 2020， 99： 12-19.
3. Luo Y， Huang X X， Song X F， Wen B B， Xie N C， Wang K B， Huang J A， Liu Z H. Identification of a WRKY transcriptional activator from"Camellia sinensis"that regulates methylated EGCG biosynthesis[J]. Horticulture Research， 2022， 9： uhac024.
4. 余婧， 楊慧， 余世洲， 趙會納， 鄭慶霞， 王兵， 雷波. 煙草NtCBT基因啟動子酵母單雜誘餌載體構(gòu)建及互作蛋白篩選[J]. 生物技術(shù)通報， 2022， 38（10）： 73-79.Yu J， Yang H， Yu S Z， Zhao H N， Zheng Q X， Wang B， Lei B. Construction of yeast one-hybrid bait vector of tobacco"NtCBT"gene promoter and screening of interacted proteins[J]. Biotechnology Bulletin， 2022， 38（10）： 73-79. （in Chinese）
5. CAO Y W， BI M M， YANG P P， SONG M M， HE G R， WANG J， YANG Y， XU L F， MING J. Construction of yeast one-hybrid library and screening of transcription factors regulating LhMYBSPLATTER expression in"Asiatic"hybrid lilies （Lilium"spp.）[J]. BMC Plant Biology， 2021， 21（1）： 563-563.
6. 晁金泉， 楊署光， 田維敏. 后基因組時代橡膠樹分子生物學(xué)[J]. 分子植物育種， 2020， 18（22）： 7404-7412.CHAO J Q， YANG S G， TIAN W M. Molecular biology of"Hevea brasiliensis"in the post genomic era[J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（22）： 7404-7412. （in Chinese）
7. 楊超， 李海英， 馬春泉. 植物中天然橡膠合成及研究進(jìn)展[J]. 黑龍江大學(xué)工程學(xué)報， 2021， 12（2）： 84-89.Yang C， Li H Y， Ma C Q. Synthesis and research progress of natural rubber in divergent plant species[J]. Journal of Engineering of Heilongjiang University， 2021， 12（2）： 84-89. （in Chinese）
8. 張長波， 孫紅霞， 鞏中軍， 祝增榮. 植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（4）： 779-786.ZHANG C B， SUN H X， GONG Z J， ZHU Z R. Plant terpenoid natural metabolism pathways and their synthases[J]. Plant Physiology Communications， 2007， 43（4）： 779-786. （in Chinese）
9. 鄒智， 楊禮富， 王真輝， 袁坤. 橡膠樹中橡膠的生物合成與調(diào)控[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（12）： 1231-1238.Zou Z， Yang L F， Wang Z H， Yuan K. Biosynthesis and regulation of natural rubber in"Hevea[J]. Plant Physiology Communications， 2009， 45（12）： 1231-1238. （in Chinese）
10. 王鵬杰， 陳丹， 曹紅利， 陳靜， 陳笛， 葉乃興. 茶樹甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因CsMVD的克隆與表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報， 2017， 37（12）： 2342-2349.Wang P J， Chen D， Cao H L， Chen J， Chen D， Ye N X. Cloning and expression of mevalonate diphosphate decarboxylase gene"CsMVD"in tea plant （Camellia sinensis）[J]. Northwest Chinese Journal of Botany， 2017， 37（12）： 2342-2349. （in Chinese）
11. 尚怡彤， 閆歡歡， 王麗紅， 田學(xué)琴， 薛萍紅， 羅濤， 胡志宏. 米曲霉磷酸甲羥戊酸激酶功能研究[J]. 生物技術(shù)通報， 2023， 39 （12）： 311-319.Shang Y T， Yan H H， Wang L H， Tian X Q， Xue P H， Luo T， Hu Z H. Study on the function of phosphomevalonate kinase in"Aspergillus oryzae[J]. Biotechnology Bulletin， 2023， 39（12）： 311-319. （in Chinese）
12. Skilleter D N， Kekwick R G. The enzymes forming isopentenyl pyrophosphate from 5-phosphomevalonate （mevalonate 5-phosphate） in the latex of"Hevea brasiliensis[J]. Biochemical Journal， 1971， 124（2）： 407-417."
13. CHERIAN S， RYU S B， CORNISH K. Natural rubber biosynthesis in plants， the rubber transferase complex， and metabolic engineering progress and prospects[J]. Plant Biotechnology Journal， 2019， 17（11）： 2041-2061.
14. Guo D， Yi H Y， Li H L， Liu C， Yang Z P， Peng S Q. Molecular characterization of HbCZF1， a"Hevea brasiliensisnbsp;CCCH-type zinc finger protein that regulates hmg1[J]. Plant Cell Reports， 2015， 34（9）： 1569-1578.
15. Li H L， Wei L R， Guo D， Wang Y， Zhu J H， Chen X T， Peng S Q. HbMADS4， a MADS-box transcription factor from"Hevea brasiliensis， negatively regulates HbSRPP[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1709.
16. DENG X M， GUO D， YANG S G， SHI M J， CHAO J Q， LI H L， PENG S Q， TIAN W M. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree，"Hevea brasiliensis[J]. Journal of Experimental Botany， 2018， 69 （15）： 3559-3571.
17. Dr?ge-Laser W， SNOEK B L， Snel B， Weiste C. The"Arabidopsis"bZIP transcription factor family-an update[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2018， 45： 36-49."
18. 孫曉麗， 李勇， 才華， 柏錫， 紀(jì)巍， 季佐軍， 朱延明. 擬南芥bZIP1轉(zhuǎn)錄因子通過與ABRE元件結(jié)合調(diào)節(jié)ABA信號傳導(dǎo)[J]. 作物學(xué)報， 2011， 37（4）： 612-619.Sun X L， Li Y， Cai H， Bai X， Ji W， Ji Z J， Zhu Y M."Arabidopisis"bZIP1 transcription factor binding to the ABRE"cis-element regulates abscisic acid signal transduction[J]. Acta Agronomica Sinica， 2011， 37（4）： 612-619. （in Chinese）
19. JING D， XUE L Z， XIN S， SHUO W， Xue Y Z， Bao X L， Yue H L， Zhao B X. Identification of"Eleutherococcus senticosus"NAC transcription factors and their mechanisms in mediating DNA methylation of EsFPS， EsSS， and EsSE promoters to regulate saponin synthesis[J]. BMC Genomics， 2024， 25（1）： 536-536.
20. Michael R， Ranjan A， Kumar S R， Pathak K P， Trivedi K P. Light-regulated expression of terpene synthase gene， AtTPS03， is controlled by the bZIP transcription factor， HY5， in"Arabidopsis thaliana[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2020， 529（2）： 437-443.
21. 彭國穎， 盧山， 楊坤， 萬瑋， 黃長干. 紫鴨跖草熱激轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定及在Cu²⁺脅迫下表達(dá)模式分析[J]. 生物工程學(xué)報， 2022， 38（1）： 238-251.Peng G Y， Lu S， Yang K， Wan W， Huang C G. Identification of heat stress transcription factors gene family in"Setcreasea purpurea"and analysis of its expression pattern under Cu^2+"stress[J]. Chinese Journal of Biotechnology， 2022， 38（1）： 238-251. （in Chinese）
22. 李言， 余文才， 陸慶志， 楊署光， 田維敏. 非生物脅迫對橡膠樹熱激轉(zhuǎn)錄因子家族成員表達(dá)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2021， 42（8）： 2119-2125.Li Y， Yu W C， Lu Q Z， Yang S G， Tian W M. Effects of abiotic stresses on the expression of heat shock transcription factor （HSF） family members in rubber tree （Hevea brasiliensis"Muell. Arg.）[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2021， 42（8）： 2119-2125. （in Chinese）
23. Kumar S M， Chanderkant C， Suchi B， Kumar A P， Parul S， Meenakshi K， Snehi G， Annu K， Debabrata S， Hugo G， Harsh C. Heat-stress-re-sponsive"HvHSFA2e"gene regulates the heat and drought tolerance in barley through modulation of phytohormone and secondary metabolic pathways[J]. Plant Cell Reports， 2024， 43（7）： 172-172.
24. Zhang X Y， Li L Y， He Y Q， Lang Z L， Zhao Y， Tao H， Li Q S， Hong G J. The CsHSFA-CsJAZ6 module-mediated high temperature regulates flavonoid metabolism in"Camellia sinensis[J]. Plant Cell Environment， 2023， 46（8）： 2401-2418.
25. Xiong W D， Xu X Q， Zhang L， Wu P Z， Chen Y P， Li M R， Jiang H W， Wu G J. Genome-wide analysis of the WRKY gene family in physic nut （Jatropha curcas"L.）[J]. Gene， 2013， 524（2）： 124-132.
26. 王藝璇， 孟慶偉， 馬娜娜. 番茄低溫響應(yīng)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析[J]. 植物生理學(xué)報， 2021， 57（6）： 1349-1362."Wang Y X， Meng Q W， Ma N N. Characterization and analysis of some chilling-response WRKY transcription factors in tomato[J]. Chinese Journal of Plant Physiology， 2021， 57（6）： 1349-1362. （in Chinese）
27. Wang Y， Guo D， Li H L， Peng S Q. Characterization of HbWRKY1， a WRKY transcription factor from"Hevea brasiliensis"that negatively regulates HbSRPP[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 71： 283-289.
28. Li H L， Guo D， Yang Z P， Tang X， Peng S Q. Genome-wide identification and characterization of WRKY gene family in"Hevea brasiliensis[J]. Genomics， 2014， 104（1）： 14-23.
29. Qu L， Li H L， Guo D， Wang Y， Zhu J H， Yin L Y， Peng S Q. HbWRKY27， a group IIe WRKY transcription factor， positively regulates HbFPS1 expression in"Hevea brasiliensis[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 20639- 20639.
30. Hayashi T， Kobayashi D， Kariu T， Tahara M， Hada K， Kouzuma Y， Kimura M. Genomic cloning of ribonucleases in"Nicotiana glutinosa"leaves， as induced in response to wounding or to TMV-infection， and characterization of their promoters[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2003， 67（12）： 2574-2583.