中圖分類號(hào)：Q785；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）10-0029-07

隨著全球氣候變暖的加劇，極端天氣事件如高溫[1]、干旱[2]等正變得越來(lái)越頻繁和劇烈。我國(guó)小麥種植尤其是冬小麥越冬期間極易遭到低溫脅迫，影響其萌發(fā)、生長(zhǎng)甚至產(chǎn)量[3]。此外，我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)河南部分地區(qū)存在土壤鹽漬化[4]等問(wèn)題。這些極端氣候、環(huán)境條件對(duì)小麥的生長(zhǎng)、種植和發(fā)育構(gòu)成極大的威脅與挑戰(zhàn)，已成為小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要制約因素之一。目前，小麥生產(chǎn)上防控逆境脅迫主要采取3種策略：一是選育和推廣抗逆境品種[5-6]；二是優(yōu)化栽培管理措施，如適期晚播以避開春季倒春寒等低溫時(shí)期，或是改良土壤等[7-9]；三是應(yīng)用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控與逆境相關(guān)的激素水平[10]。然而，由于缺乏理想的抗性基因資源，生產(chǎn)上真正具有顯著抗性的品種較少。同時(shí)，化學(xué)抑制劑的使用不僅成本高、操作繁瑣，還可能造成環(huán)境污染，難以在生產(chǎn)實(shí)踐中大面積推廣應(yīng)用。因此，克隆小麥抗逆相關(guān)基因并深人研究其功能，對(duì)于加快小麥利用基因工程技術(shù)培育抗逆品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI，編號(hào)EC5.3.1.1）是一種催化磷酸二羥丙酮（DHAP）和3-磷酸甘油醛（GAP）可逆轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[11-12]。該酶參與糖酵解、卡爾文循環(huán)、脂肪酸生物合成等多個(gè)代謝途徑，在種子萌發(fā)、碳代謝和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-14]。TPI 主要以同源二聚體形式存在，每個(gè)亞基由1條多肽鏈組成，蛋白分子量約27.5ku 。不論細(xì)菌還是哺乳動(dòng)物，該酶幾乎在所有生物中都普遍存在[15]。植物體內(nèi)存在2 種亞細(xì)胞定位的TPI，包括參與糖酵解的胞質(zhì)型TPI（cTPI）和參與卡爾文循環(huán)的質(zhì)體型 。盡管TPI催化的可逆反應(yīng)長(zhǎng)期以來(lái)未受到足夠重視，但近年來(lái)的研究表明該酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有不可替代的作用。近期國(guó)內(nèi)外對(duì)TPI的生物學(xué)功能研究日益深人[17-21]。自1986年 Marchionni 首次從玉米中分離出TPI相關(guān)基因以來(lái)[22，該基因相繼在水稻、燕麥、菠菜、擬南芥等植物中被克隆并進(jìn)行了初步功能研究。Dorion等研究發(fā)現(xiàn)，抑制cTPI表達(dá)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯根系表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的碳代謝和脂質(zhì)合成能力，根系生長(zhǎng)速率明顯快于野生型[23]Sharma等的研究表明，在低溫、過(guò)氧化氫和甲基乙二醛脅迫下，水稻OscTPI的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)1.5～2倍[24]。Ito等的研究表明，TPI是氧化脅迫條件下調(diào)控糖酵解和三羧酸循環(huán)效率的關(guān)鍵酶之—[25]。

筆者所在課題組前期通過(guò)小麥蛋白組學(xué)鑒定到1個(gè)在吸漲 ^48h 的籽粒中高表達(dá)的胞質(zhì)型TPI蛋白，推測(cè)其可能在非生物脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。鑒于目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于小麥TPI的研究較少，本研究以已獲得的TPI部分序列為基礎(chǔ)，通過(guò)小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)克隆該酶的編碼基因，并系統(tǒng)分析其在不同組織各種非生物逆境[高溫、低溫、高鹽、干旱和脫落酸（ABA）]脅迫下的表達(dá)特征，以期為深入闡明該基因在逆境下的生理生化功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)所用小麥品種為百農(nóng)207，該品種由筆者所在課題組保存。試驗(yàn)于2022—2023年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。篩選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的小麥種子，經(jīng)過(guò)表面滅菌后置于滅菌水中浸種，室溫下 22～26^°C 吸脹 24h 后進(jìn)行試驗(yàn)處理：（1）取部分萌動(dòng)種子，待其發(fā)芽10d后移入土壤中生長(zhǎng)直至成熟，期間依次取根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后 25d 的籽粒，作為時(shí)空表達(dá)分析用材料；（2）另取剩余籽粒，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的小麥種子放入發(fā)芽床，用1/2霍格蘭氏（Hoagland's）營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培養(yǎng)（每2d更換1次營(yíng)養(yǎng)液），并置于光周期為光照 12h 、黑暗 ^12h ，溫度 25°C 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2葉1心期后一部分小麥分別放人提前配制的含有100mmol/LNaCl （高鹽） .20% PEG-6000（干旱）、100μmol/L 脫落酸（ABA）的溶液中進(jìn)行處理；（3）取其余均勻一致的樣品置于溫度為 42，4‰ 的光照培養(yǎng)箱（其余生長(zhǎng)條件不變）中，分別作高溫和低溫處理。以正常生長(zhǎng)條件下（以1/2霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)且在正常溫度下生長(zhǎng)，無(wú)逆境脅迫）的幼苗為對(duì)照。分別剪取正常生長(zhǎng)條件下（對(duì)照）和經(jīng)歷0.5、1、2、6、12、24、48、72h 脅迫處理的根系，作為表達(dá)分析用材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成參照賽默飛公司的Cells-to -CT^TM 試劑盒說(shuō)明書提取小麥組織總RNA，用新配制的 0.8% 非變性瓊脂糖凝膠檢測(cè)小麥總RNA的完整性（是否降解）。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在 260.280nm 處的吸光度，濃度達(dá)標(biāo)的樣品才可進(jìn)行下一步操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Invitrogen公司M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。

1.2.2小麥TaTPI基因cDNA編碼框的克隆以篩選所得目的基因部分序列為種子序列，在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//plants.ensembl.org/index.html）中進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果在其預(yù)測(cè)的編碼框兩端用PrimerPremier5.O軟件設(shè)計(jì)特異性引物F1：5^′ -CCAACCCGATCCGATCTCC-3'和R1： 5^′ -TCCACCACAAAATTACTAGCATAG- 3^′ ，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后將所獲得的PCR產(chǎn)物回收并測(cè)序比對(duì)，驗(yàn)證克隆基因準(zhǔn)確性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物， TaTPI-3AS 基因引物F2： 5^′ -ATGGGAGAATCAAGCGAGTT -3^′ 和 R2：5^′ -GTTCGTAAGCGACAAC

CTCA-3'; TaTPI-3BS 基因引物F3：5'-CTGGGTCATTCTTGGACACTCT -3^′ 和R3： 5^′ -CCAGTCCTTGATCTTGCCTGT- ?3^′ TaTPI-3DS 引物 F4：5^′ - TTGTCGCTGAACAGACAAAAGC- 3^′ 和 - CTGTGCCTGAGCCGGTGA -3^′ 。設(shè)計(jì)小麥看家基因 β -actin（GenBank登錄號(hào)：AB181991）引物 F5：5^′ -CCAAGGCGGAGTACGATGAGTCT -3^′ 和 R5：5^′ -TTCATACAGCAGGCAAGCACCAT- 3^′ ，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系及程序參照SYBRGreenqPCR試劑盒（品牌：TaKaRa）說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果計(jì)算采用相對(duì)定量方法：讀取每個(gè)處理相應(yīng)的 C_T 值后，采用 方法計(jì)算[26]

1.2.4生物信息學(xué)分析使用DNAstar軟件分析并預(yù)測(cè)TaTPI基因蛋白序列，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì);通過(guò)NCBI提供的核心生物信息學(xué)工具BLAST將克隆基因的cDNA、氨基酸序列與已知的TPI基因進(jìn)行同源性比對(duì)；在NCBI上分析保守結(jié)構(gòu)域；利用MEGA7.0軟件的neighbor－joining算法對(duì)不同物種TPI家族基因的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1小麥TaTPI基因完整編碼框序列的克隆及序列分析

為獲得小麥TPI基因完整編碼序列，以筆者所在課題組前期獲得的部分cDNA序列為種子序列，檢索小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果在預(yù)測(cè)的完整編碼框兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物F1和R1，以小麥開花后20d的籽粒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，1、2泳道均在 750～1 000l p區(qū)間擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 914bp 的特異性條帶。將目標(biāo)條帶回收并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，測(cè)序結(jié)果證實(shí)所克隆的片段為目標(biāo)序列。使用DNAMAN軟件與已知序列比對(duì)，獲得3條高度同源的cDNA序列。通過(guò)URGI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/）比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的TPI基因定位于小麥第3染色體短臂上，據(jù)此將這3條序列分別命名為TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS。

序列分析顯示（圖2），TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS的cDNA全長(zhǎng)分別為91O、908、910bp 。其中 5^′UTR （非翻譯區(qū)）長(zhǎng)度分別為35、31、34bp，3'UTR長(zhǎng)度分別為113、115、114bp，均含有1個(gè)長(zhǎng)度為 762bp 的開放閱讀框（ORF），編碼253個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量分別為26.77、 ，理論等電點(diǎn)分別為5.57、5.38、5.38，均屬于酸性蛋白。通過(guò)NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，這3個(gè)基因均屬于TIM超家族。DNAMAN序列比對(duì)分析顯示，3條cDNA序列的一致性為97.27% 。其中，編碼區(qū)序列相對(duì)保守，僅存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）差異；而在 5^′UTR 和 3^′ UTR存在多處堿基的缺失或插入。

2.2小麥TaTPI編碼的氨基酸序列分析

使用DNAMAN軟件對(duì)克隆獲得的3條TaTPI基因編碼的氨基酸序列，并進(jìn)行比對(duì)分析（圖3）。結(jié)果顯示，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS蛋白在8個(gè)位點(diǎn)存在差異，分別位于第2、54、142、152、153、161、203、223位氨基酸殘基。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，TaTPI-3AS與TaTPI-3BS編碼的蛋白的保守區(qū)域存在5處差異， TaTPI-3BS 與TaTPI-3DS編碼的蛋白的保守區(qū)域存在8處差異。通過(guò)NCBIBLAST分析比較克隆獲得的小麥TaTPI蛋白序列與已知TPI蛋白的同源性。結(jié)果顯示，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS蛋白與二穗短柄草（ XP-OO3568647.I） 的相似度分別為 91.34% ！90.12% （204號(hào) 90.94% ，與大麥（ ?KAE876802I.I） 的相似度分別為 94.49%.94.07%.93.70% 。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)克隆獲得的基因?yàn)樾←淭PI基因。上述結(jié)果表明，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS這3個(gè)同源蛋白之間存在一定的氨基酸序列差異，這種差異可能導(dǎo)致它們?cè)谛←溁虮磉_(dá)過(guò)程中采用不同的調(diào)控方式。

2.4小麥TaTPI的表達(dá)特性分析

2.4.1小麥TaTPI的時(shí)空表達(dá)特性為探究TaTPI基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)模式，選取小麥的根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后25d的籽粒進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果（圖5）表明，3個(gè)同源基因在所檢測(cè)的組織中均可檢測(cè)到表達(dá)，且呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式：TaTPI-3BS、TaTPI-3DS均在幼穗中相對(duì)表達(dá)量最高，其次為旗葉和莖，葉片、根中也有一定表達(dá)，而在籽粒中的表達(dá)量相對(duì)較低，表明該基因具有明顯的組織特異性表達(dá)特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因的表達(dá)水平存在差異。幼穗中，TaTPI-3DS的相對(duì)表達(dá)量顯著高于TaTPI-3BS、TaTPI-3AS。

2.4.2小麥TaTPI在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性分析為了進(jìn)一步明確TaTPI在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)高溫、低溫、高鹽、干旱、ABA等逆境條件的響應(yīng)特征，利用qRT-PCR分析了TaTPI在上述條件下的表達(dá)模式。結(jié)果（圖6）表明， 100μmoL/L ABA處理下， TaTPI-3AS，TaTPI-3BS 均在處理 0.5h 后表達(dá)水平迅速上調(diào)， ¹h 后快速下調(diào)，之后維持在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的水平； TaTPI-3DS 表達(dá)水平表現(xiàn)出相類似的變化趨勢(shì)，但該基因下調(diào)速率相對(duì)滯后，在處理1h后才開始下降。TaTPI基因在ABA處理過(guò)程中，相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照，說(shuō)明該基因可能是依賴于ABA調(diào)控的基因。

在極端溫度 （4，42‰ ）處理下，TaTPI基因在小麥根系中表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)表達(dá)特性。但不同基因之間有些許差異。在整個(gè)脅迫處理過(guò)程中，除TaTPI-3BS在低溫下表達(dá)無(wú)特異性外， TaTPI 表達(dá)水平整體上呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)， 4，42^°C 處理下，TaTPI-3AS在 2h 后開始上調(diào)，TaTPI-3DS在^1h 后開始上調(diào)，在 42°C 處理下TaTPI-3BS表現(xiàn)為在 6h 后開始上調(diào)。雖然表達(dá)水平在脅迫中后期有所波動(dòng)，但3個(gè)基因表達(dá)水平均低于對(duì)照，表明該基因可能在脅迫初期應(yīng)對(duì)極端溫度保護(hù)中起著重要的調(diào)控作用。

在100mmoL/LNaCl處理下，TaTPI基因在對(duì)照和處理中的表達(dá)均呈現(xiàn)先下降后上升再維持相對(duì)較高表達(dá)的變化趨勢(shì)，即在脅迫 0.5h 后表達(dá)下調(diào)至極小值后， 6h 后又開始上調(diào)并維持一個(gè)相對(duì)較高的表達(dá)水平。在整個(gè)脅迫處理過(guò)程中，TaTPI基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照。

在 20% PEG6000處理下，小麥根系中TaTPI基因表達(dá)水平呈現(xiàn)出與NaCl處理類似的變化趨勢(shì)。TaTPI-3AS，TaTPI-3BS，TaTPI-3DS 相對(duì)表達(dá)量均在脅迫 0.5h 時(shí)達(dá)到較高水平后下調(diào)，至 ¹h 達(dá)到最低值后開始上調(diào)并在處理后期維持一個(gè)相對(duì)較高的水平，但在表達(dá)量上存在差異。在整個(gè)脅迫處理過(guò)程中， TaTPI-3AS，TaTPI-3BS 表達(dá)水平始終低于對(duì)照，而TaTPI-3DS在脅迫處理的12、48、^72h 高于對(duì)照，表明3個(gè)基因可能在干旱脅迫后期的脫水保護(hù)中起著不同的調(diào)控功能。

3結(jié)論與討論

植物對(duì)環(huán)境脅迫的感知和調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，涉及許多脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控。TPI家族蛋白的生物學(xué)功能研究一直備受關(guān)注，但現(xiàn)有研究主要集中在動(dòng)物系統(tǒng)，而在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究相對(duì)有限。TPI家族在植物的新陳代謝中發(fā)揮著重要作用，幾乎所有涉及三糖磷酸酯的代謝途經(jīng)（如糖酵解、糖異生、戊糖磷酸途徑、脂肪酸生物合成等）均有TPI 酶的參與[27-28]，并且有研究表明TPI基因在響應(yīng)植物逆境方面發(fā)揮著重要的作用[29-31]。為此，為了驗(yàn)證其功能，本研究從普通小麥中成功克隆了3個(gè)TPI同源基因的完整編碼序列。序列分析表明，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS的cDNA全長(zhǎng)分別為910、908、910bp，它們均包含762bp的開放閱讀框（ORF），序列間存在38個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。氨基酸序列分析顯示，這3個(gè)基因均編碼253個(gè)氨基酸殘基，但在第2、54、142、152、153、161、203、223位等8個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸差異，提示這些同源基因可能在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與不同的調(diào)控過(guò)程。

熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)TaTPI同源基因在不同組織中的表達(dá)模式基本一致，在根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后25d的籽粒中均有表達(dá)，其中幼穗中表達(dá)量高于其他組織。前人的研究表明，馬鈴薯葉片在快速生長(zhǎng)期間TPI活性增強(qiáng)[23]，這與本研究試驗(yàn)結(jié)果一致。為進(jìn)一步闡明TaTPI基因在抵抗逆境中的作用，通過(guò)施加脅迫（高溫、低溫、高鹽、PEG 模擬干旱、添加ABA）推測(cè)其對(duì)脅迫的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，除PEG處理外，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS在逆境脅迫整個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)為下調(diào)； TaTPI-3DS 在PEG處理下前期也表現(xiàn)為下調(diào)，在PEG處理 12，48，72h 表現(xiàn)為上調(diào)。這些結(jié)果表明，TaTPI基因的表達(dá)與植物逆境抗性密切相關(guān)，且相似的表達(dá)模式提示這3個(gè)同源基因在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中可能起著相似的調(diào)控作用。

然而，TaTPI基因在逆境響應(yīng)過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，包括探究TaTPI基因與其他調(diào)控因子的互作關(guān)系，驗(yàn)證其在植物逆境抗性形成中的因果關(guān)系，闡明3個(gè)同源基因功能分化的分子機(jī)制等。這些研究將為培育逆境抗性小麥品種提供重要的理論基礎(chǔ)。

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