中圖分類號：0657.37文獻標志碼：A

Surface-enhanced Raman scattering detection of amino acids based on Au @ Ag nanoparticles

CHANGMin，LIU Huifang，SHI Yueyan，ZHANG Jiachang，LI Shibo，HE Chen （School of Optical-Electrical and Computer Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093，China）

Abstract： Surface-enhanced Raman scattering （SERS） is widely employed for amino acids quantitative analysis due to its high-sensitivity molecular feature extraction and multiplex detection advantage. Stable and highly sensitive SERS substrates are crucial for achieving precise detection. Gold core silver shell nanoparticles （Au@Ag NPs） combine the chemical stability of gold nanoparticles with the high SERS enhancement effect of silver nanoparticles.They enable the screening and detection of seven amino acids， including phenylalanine and alanine. Except for isoleucine and glycine， which exhibited relatively lower sensitivity，the detection limits for the remaining amino acids reached 1×10^-4mol/L . A linear correlation existed between concentration and SERS signal intensity， with correlation coefficients exceeding 0.94. This study provides a reference method for simultaneous quantitative detection of multiple amino acids on a single substrate.

Keywords： amino acid; surface-enhanced Raman scatering; Au@Ag NPs; quantitative detection

引言

氨基酸是構成蛋白質(zhì)的基本單元，在人體生命活動中發(fā)揮重要作用，因此對必需氨基酸需保證日常攝人。但該類物質(zhì)在生物體內(nèi)含量較少且成分復雜，其含量測定面臨顯著挑戰(zhàn)[。目前，氨基酸成分的分離檢測方法包括氨基酸自動分析儀法、色譜法[2、分光光度法3]及近紅外光譜法[4]。這些方法耗時長且需要專業(yè)人員操作，難以推廣應用。因此，迫切需要開發(fā)高效的氨基酸檢測方法。

表面增強拉曼散射（surface-enhancedRamanscatting，SERS）是一種通過分子振動來獲取分子特征圖譜的高靈敏度分子檢測技術[5。它可以實現(xiàn)對分子的快速無損檢測[，已被廣泛應用于生物醫(yī)學、食品安全和化學分析等領域[]。高靈敏度、高增強因子基底可顯著提升SERS檢測性能。隨著SERS技術的持續(xù)發(fā)展，新型基底材料及制備方法不斷涌現(xiàn)[8。周俊杰等[利用磁控濺射結(jié)合脫合金技術制備出的島狀納米多孔金基底對羅丹明進行檢測，結(jié)果顯示SERS光譜強度和檢測物質(zhì)濃度的動態(tài)響應范圍可達3個數(shù)量級。黃夢萍等[1采用 ZIF-8@Au 復合基底對多種氨基酸進行篩選性檢測，實驗結(jié)果顯示該基底對氨酸、半胱氨酸和色氨酸在 10^-1～10^-3mol/L 濃度范圍內(nèi)具有較好的線性響應。但上述文獻中所使用的SERS基底合成步驟復雜，且常需使用有毒化學物質(zhì)，因此需開發(fā)更簡單環(huán)保的增強基底制備方法。Kneipp 等[1證明，球形納米顆粒比其他形態(tài)的納米顆粒能產(chǎn)生更強的SERS信號。另外，核殼SERS基底由兩種或多種材料組合而成，不僅兼具各組分材料特性，還在界面處產(chǎn)生局部表面等離子體共振（localizedsurfaceplasmonresonance，LSPR），從而增強 SERS 效果[12]。

鑒于上述分析，本文采用金核銀殼納米粒子 gold core silver shell nanoparticles， Au@Ag

NPs）對氨基酸進行SERS檢測。該結(jié)構兼具金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）的化學穩(wěn)定性和銀納米粒子（silvernanoparticles，AgNPs）的SERS增強效應。外層的銀殼可有效屏蔽金核合成階段殘留的檸檬酸鈉對檢測的干擾，同時納米粒子間形成的LSPR熱點能顯著增強目標分子的 SERS信號[13-14]

1 實驗部分

1.1 實驗藥品和儀器

硝酸銀（ AgNO₃ ，質(zhì)量分數(shù) ω=99.9% ），氯金酸 RAuCl₄ ， ω=99% ），羅丹明6G（R6G，ω=95% ），色氨酸（ ω=99% ）、甘氨酸（ ω= 99.5% ）、酪氨酸（ ω=99% ）、氨酸（ ω= 99% ）、異亮氨酸（ ω=99% ）、亮氨酸（ ω= 99% ）、精氨酸（ ω=98% ）、賴氨酸（ ω=98% ）、天門冬氨酸（ ω=99% ）、谷氨酸（ ω=99% ）、苯丙氨酸（ ω=99% ）、絲氨酸（ ω=99% ）、組氨酸（ ω=99% ）、脯氨酸（ ω=99% 和丙氨酸（ ω= 99% ）購自上海麥克林，檸檬酸鈉（ Na₃C₆H₅O₇ 2H₂O ， ω=99.99% ）購自上海阿拉丁。所用化學試劑均為分析純。超純水（電阻率 18.2MΩ^.cm， 0用純水機（UPT-I-5，成都優(yōu)普）制備。所有玻璃器皿在使用前后均用大量去離子水清洗。實驗廢液均按要求進行了分類收集。

使用紫外-可見分光光度計（UV-2600i，日本島津）在 300～800nm 波段測定AuNPs和Au@AgNPs 的吸收光譜。使用共聚焦拉曼光譜儀（XploRAPLUS，HORIBA Scientific）對目標樣本進行SERS測試。使用納米粒度電位儀（ZetasizerNano-ZS90，英國馬爾文）進行粒度分布的測定。

1.2 Au NPs和 Au@AgNPs 的制備

本研究通過檸檬酸鈉還原 HAuCl₄ 來制備球形金納米粒子。在 100mL 錐形瓶中加入 99mL 超純水， 280r/min 磁力攪拌加熱。至 50% 時加人 1mL HAuCl₄ 溶液，持續(xù)加熱至沸騰后，快速添加 2.5mL 新配制的檸檬酸鈉（ ω=1% ，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 380r/min 。 Au³⁺ 被檸檬酸鈉還原，維持沸騰條件至溶液由淡黃色變?yōu)榫萍t色。停止加熱后繼續(xù)攪拌 20min 獲得金溶膠，室溫靜置冷卻。取適量溶膠離心（ 9600r/min ， 10min ，離心半徑 15cm ），除去上清液后得到濃縮AuNPs沉淀。將其保存于棕色玻璃瓶中， 4^°C 存放備用。

將金納米粒子作為種子，采用種子生長法獲得金核銀殼納米粒子。將濃縮的AuNPs沉淀磁力攪拌 380r/min 加熱至 60^°C 時，加人 5mL 檸檬酸鈉（ ω=1% ）。持續(xù)加熱至沸騰后，迅速加入 1.8mL0.1molL 的 AgNO₃ 溶液，繼續(xù)攪拌并持續(xù)煮沸 40min 。之后停止加熱，繼續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫。檸檬酸鈉會將 AgNO₃ 中的 Ag⁺ 還原為單質(zhì)銀。單質(zhì)銀將附著在金種子表面形成銀殼。當溶液從酒紅色慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)榻固巧珓t表明金核銀殼納米粒子已經(jīng)形成。將金銀溶膠離心（ 9600r/min ， 10min ，離心半徑 15cm ），除去上清液后得到濃縮 Au@AgNPs 沉淀。將其保存于棕色玻璃瓶中， 4°C 存放備用。圖1所示為金核銀殼納米粒子的制備過程。

1.3 SERS檢測

制備濃度為 0.1mol/L 的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、酪氨酸、組氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、纈氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和脯氨酸溶液，以及濃度為 1mmol/L 的R6G溶液，待測備用。

取 25μL Au NPs或 ，分別滴加在載玻片上，再滴加 25μL 待測樣品。使用共聚焦拉曼光譜儀進行SERS測試，參數(shù)設置為：激光功率 15mW ，波長 638nm ，顯微物鏡10× ，積分時間 3s ，曝光次數(shù)2次[15]，狹縫寬度 30μm ，分辨率 5cm^-1 ，光譜采集范圍 300～ 1800cm^-1 。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@AgNPs 的表征

使用紫外-可見分光光度計測定AuNPs和Au@AgNPs 的吸收光譜，結(jié)果如圖2（a）所示。Au NPs在 520nm 附近有一個較強的吸收峰，與金的表面等離子體共振相一致[16-17]。Au@Ag NPs的吸收峰位于 420nm 附近，該峰歸因于銀的橫向等離子體共振吸收[18]。這兩個吸收峰證明溶膠中存在Au和Ag兩種納米粒子。吸收峰的半峰寬與納米顆粒粒徑分布正相關，峰寬越窄表明顆粒尺寸均一性越高。為進一步描述襯底顆粒的大小，采用納米粒度電位儀測定兩種粒子的粒徑分布，結(jié)果如圖2（b）所示：AuNPs和 NPs的平均粒徑分別為17和 48nm 左右，且均勻性較好。納米顆粒的粒徑會影響SERS基底增強效果。通常，粒徑減小會導致比表面積增大，引發(fā)LSPR峰藍移（峰值波長減?。欢皆龃髣t會減小比表面積，導致LSPR峰紅移（峰值波長增大）[]?；咨舷噜?Au@AgNPs 間的間隙越小，形成的 LSPR 熱點密度越高[19]。

一般情況下，將拉曼探針分子作為待測物質(zhì)，對所制備的金屬納米粒子的SERS基底增強效果進行校驗。R6G因其優(yōu)異的拉曼特性，以及在金屬納米粒子表面選擇性的吸附能力，被廣泛用作拉曼探針分子[20]。采用 1mmolLR6G 溶液作為標準樣品進行SERS檢測，通過對比其在不同基底（ AuNPs 與 Au@AgNPs ）上的信號強度，評估兩種納米材料的增強效應。如圖3（a）和（b）所示，在 1 520cm^-1 處， Au@AgNPs 的SERS信號強度約為AuNPs的2倍，結(jié)合20個隨機點測量的 Au@AgNPs 的峰強度相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD）為 1.8% ，表明 Au@AgNPs 基底增強效果及穩(wěn)定性均優(yōu)于AuNPs。接著，繪制了 8μm×8μm 區(qū)域的SERS映射圖，并分析了對應的光譜數(shù)據(jù)。如圖3（c）所示，R6G在 1 520cm^-1 處的映射圖顏色分布均勻，表明 Au@AgNPs 的增強效果具有高度的一致性和良好的可重復性。對 NPs表面64個隨機位點進行SERS重復檢測，所得光譜圖高度重疊，表明其具有穩(wěn)定的增強性

2.2 氨基酸的SERS特性

因 Au@AgNPs 具有更好的增強性和穩(wěn)定性，選其作為基底，對氨基酸進行檢測。結(jié)果顯示， Au@AgNPs 對苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的響應較好，具體的拉曼光譜見圖4，各拉曼特征峰位置及其歸屬見表1。實驗所測得的各氨基酸主要拉曼峰位置與文獻[21-30]所報道的基本一致。

圖5所示為不同濃度的苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的SERS光譜圖?？梢钥吹?，隨著氨基酸濃度的降低，SERS信號強度也隨之變?nèi)?。當濃度?.1、0.01和 0.001mol/L 時，分別選取1001、1397和 1638cm-1 處的峰作為苯丙氨酸、丙氨酸和精氨酸的濃度特征峰，其信號強度與濃度呈線性關系，相關系數(shù)分別為 $R _ { ☉ ＼Vec { P } ＼Vec { P } } ^ { 2 } = 0 . 9 8 2 6$ ， ，R?//H2=0.9901 ，詳見圖 。 Au@AgNPs 對酪氨酸和組氨酸的檢測更為靈敏，檢測限可達 1×10-4mol/L 。分別選取1585和 1574cm-1 處的峰作為酪氨酸和組氨酸的濃度特征峰，其信號強度和濃度呈線性關系，相關系數(shù)分別為RHHK2=0.9907 ， ，詳見圖 5（g）～（j） 。但對于異亮氨酸和甘氨酸， Au@AgNPs 對其檢測限僅為 1×10-2mol/L ，靈敏度不高，見圖 5（k）～ （1）。從圖5可知，基于 Au@AgNPs 基底，這7種氨基酸在 0.01mol/L 濃度時的SERS信號強度遠低于 0.1mol/L 濃度時的信號強度。這表明，在氨基酸的SERS檢測中，目標物濃度是影響檢測限和檢測精度的重要因素，也提示增加氨基酸富集度是提高檢測精度的有效途徑。

3總結(jié)

與單一AuNPs基底相比，Au@AgNPs基底的核殼結(jié)構通過調(diào)諧LSPR特性顯著增強SERS效應。小粒徑 Au@AgNPs 因表面能較高更易聚集，在電磁耦合作用下，相鄰粒子間形成高密度熱點，進一步放大拉曼信號。利用Au@AgNPs 基底，實現(xiàn)了對苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸等7種氨基酸的SERS檢測。當濃度為 1×10^-1～1×10^-3mol/L 時，以上氨基酸的濃度與SERS信號強度呈線性相關，且相關系數(shù)均大于 0.94 。與其他SERS基底制備方法相比，本文的制備方法具有環(huán)境友好、操作簡便等優(yōu)勢，適用性更廣?；谠摲椒ㄖ苽涞?Au@AgNPs 基底對苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸、異亮氨酸和甘氨酸均表現(xiàn)出顯著的SERS增強效應，并支持單基底多目標檢測，從而能節(jié)約制備時間并簡化流程，為后續(xù)利用同一基底進行多分子定量檢測提供高效參考方案。

參考文獻：

[1]WUKJ，XIE W H，CHEN Z，et al.Disturbed hippocampal histidine metabolism contributesto cognitive impairment induced byrecurrent nonsevere hypoglycemiaindiabetes[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2023，682： 325-334.

[2]CHENST，WANG WJ，XUSH，etal.Single nanoparticle identificationcoupled with auto-identify algorithm forrapid and accurate detection of Lhistidine[J]. Analytica Chimica Acta， 2021，1187： 339162.

[3]MAJX，LIUP，WANGYX，etal.Ahistidine-rich fusion tag enablesreal-time monitoring of recombinant protein expression byPaulyreaction-basedcolorimetric assay[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2023， 666： 128-136.

[4]ZHONG JJ， XIA L P，XUE L R， et al. Analytical method for histamine， urocanic acid isomers，and their precursor histidine in fish sauce based on precolumn dansylation andhigh-performance liquid chromatography[J]. Food Control， 2023，147： 109566.

[5］張壘.貴金屬納米粒子的催化性能及檢測研究[D]. 上海：上海工程技術大學，2020

[6］徐曉飛，荊智玉，張玲.納米多孔銀的制備及其表面 增強拉曼散射特性研究[J].光學儀器，2023，45（3）： 8-14.

[7]YAO KB， XIE X， JIAO JW， et al. Plasmonic cellulose microfilamentassistedSERsdetectionin microfluidics[J].SpectrochimicaActaPartA： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2024， 308： 123631.

［8］周秀軍.基于拉曼光譜的食用植物油定性鑒別與定 量分析[D].杭州：浙江大學，2013.

[9］周俊杰，張玲.島狀納米多孔金制備及其 SERS 特性 研究[J].光學儀器，2022，44（3）：23-30.

[10]黃夢萍，薛偉，張玉琦，等.基于ZIF-8@Au復合基底 對多種氨基酸的SERS檢測[J].光譜學與光譜分析， 2023，43（7）： 203-204.

[11]KNEIPP K，WANG Y，KNEIPP H，et al. Single molecule detection using surface-enhanced Raman scattering （SERS）[J]. Physical Review Letters，1997， 78（9）： 1667 -1670.

[12]邴丕彬，姚建銓，黃曉慧，等.表面等離子體共振類熊 貓型光子晶體光纖傳感器[J].激光與紅外，2011， 41（7）： 784- 787.

[13]PANDE S，CHOWDHURY J，PAL T，etal. Understanding the enhancement mechanisms in the surface-enhanced Raman spectra of the1，10- phenanthroline molecule adsorbed on a Au@Ag bimetallic nanocolloid[J]. The Journal of Physical Chemistry C，2011，115（21）： 10497-10509.

[14]SONG L L，MAO K，ZHOU X D，et al.A novel biosensor based on Au@Ag core-shell nanoparticles for SERS detection of arsenic （II）[J]. Talanta， 2016，146： 285-290.

[15]馬浩，張玲.金銅雙金屬表面增強拉曼散射基底的制 備及應用[J].光學儀器，2022，44（5）：35-41.

[16]JANSH，HUO Q.Gold nanoparticle-enabled biological and chemical detection and analysis[J]. Chemical Society Reviews，2012，41（7）： 2849-2866.

[17]ZHOU Y S， ZHAO G， BIAN JM， et al. Multiplexed SERS barcodes for anti-counterfeiting[J]. ACS Applied Materialsamp; Interfaces，2020，12（25）：28532-28538.

[18]NA WD，OUCJ，MING YJ，et al.A SERS nanoswitch basedon Cu（II） -mediated dual-ligand AuNPs reversible aggregation for pyrophosphate ions detection[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 2023， 385： 133725.

[19]虞丹尼.幾種羧基生物分子的Raman光譜及其表面 增強拉曼散射（SERS）研究[D].重慶：西南大學， 2008.

[20]LE RU E C， ETCHEGOIN PG. Principles of surfaceenhancedRamanspectroscopy[M].Amsterdam： Elsevier，2009.

[21]劉文涵，楊未，張丹.苯丙氨酸銀溶膠表面增強拉曼 光譜的研究[J].光譜學與光譜分析，2008，28（2）： 343 -346.

[22]龔龔，易芳，王文清.丙氨酸對映體單晶的變溫偏振 激光拉曼光譜研究[J].光散射學報，2002，14（3）： 145 -149.

[23]龔龔，王文清.DL-丙氨酸晶體粉末的拉曼光譜研究 [J].光譜學與光譜分析，2006，26（1）：90－93.

[24]李小軍.甘氨酸二聚體在銀團簇表面吸附的結(jié)構和 表面增強拉曼光譜[J].原子與分子物理學報，2016， 33（4）： 603 - 607.

[25]司民真，岳開華，武榮國，等.甘氨酸在正、負電性納 米銀上的吸附及振動譜的密度泛函計算[J].光散射 學報，2006，18（4）： 336-343.

[26]張玲，曹曉衛(wèi)，趙洪俠.金與銀電極表面甘氨酸分子 吸附作用的SERS光譜研究[J].化學研究與應用， 2012，24（3）： 356-364.

[27]張宏森，周揚，張鋼.精氨酸的電子結(jié)構和光譜性質(zhì) [J].黑龍江科技學院學報，2010，20（3）：206－210， 215.

[28]曹曉衛(wèi)，錢慶慶，鄧衛(wèi)芹，等.銀電極表面異亮氨酸單 分子膜結(jié)構和表面性質(zhì)的表面增強拉曼光譜研究 [J].化學學報，2010，68（2）：107–114.

[29]LIHJ，WANGJF，F(xiàn)ANG HQ，et al.Hydrophilic modificationofPVDF-basedSERsimprinted membrane for the selective detection ofL-tyrosine[J]. Journal of Environmental Management， 2022，304： 114260.

[30]EMRE AYHANM. CVD graphene-based flexible and transparentSERSsubstratetowardsL-tyrosine detection[J]. Microelectronic Engineering，2021， 241： 111546.